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RNA实验

16S RNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹 图谱分析微生物菌群实验

RNA
2024-06-14 RNA实验 加入收藏
材料与仪器步骤疏水面的水将滑落)。5.用滚筒固定胶贴后移去纸保护层。6.用纸巾轻轻吸干胶贴。7.用 9 6 % 乙醇清洗分隔条,并放于胶贴的左右两侧。8.将小玻


材料与仪器

步骤

2.材料 2.1 利 用 试 剂 盒 ( FastDNASPINKit) 分离 DNA F a s t D N A S P I N K i t (用于土壤)( Q B I O g e n e , C a m b s , UnitedKingdom) 是商品 化的 D N A 分离试剂盒,在实验室中常用于广泛的环境介质检测,包括土壤、沉积物、 排泄物。也可采用其他D N A 分离方法。 2.2 PCR P C R 可以用 T a g 聚 合 酶 ( Invitrogen) 在 P C R 仪 (W h a t m a n Biometra T h e r m o c ycler, G 6ttingen, G e r m a n y ) 中 进 行 ( 见注释 1)。 不 加 模 板 ( D N A ),先准备基本成分: 1. 5 , 10 X P C R 缓 冲 液 (10 X 缓 冲 液 : 200 m m o l / L Tris-H C l , p H 8.4, 500 m m o l / L K C 1)。 2. 3 juL M g C l 2 (50m m o l /L )〇 3. I 上 游 引 物 (10 M m o l/L )。 4. I juL 下 游 引 物 (10 f /m o l/L )。 5. I p.L d N T P (10 m m o l /L ) 〇 6. 0. 25 p L T 叫 D N A 聚 合 酶 (5 U /p L )。 7. 37. 75 (JL MilliQ 水 。 共 49 M L 的反应体积。 配制时将上面的每一组分乘以需要的反应次数,多加一份。分装在〇.2 m L P C R 管 (每管 49 ^1L ) 中。最 后 加人 模 板 D N A (I pdL)。每一反应中最终模板的量应在1〇
100 ng之间。将离心管放人P C R 仪中,开始按设定反应扩增。 2.3 DGGE 2. 3.1 D G G E 仪器设备部分 1. 大、小 玻 璃 板 (20c m 系统, Bio-R a d )。 2. Gelbond (胶贴 , T e b u -bio, w w w .tebu-bio.c o m ) 〇 3. Bio-Rad D G G E 设 备 ,包括 : a•温度控制模块包括加热器、搅拌器、泵和电泳导线。 b•电泳槽—盛电泳缓冲液。 c. 三明治芯—在每边固定一个胶板,安装后,每块胶板形成上缓冲液槽的一 面 ,里面的玻璃板紧贴于芯上的塑胶垫,形成上槽无油脂的密封环境。 d•三明治夹(20c m 系统) 。 e. 分隔条。 f. 梳子。 4 . 电 源 ( Bio-R a d )。 5 . 泵 和 混 合 槽 ( Bio-R a d )。 2. 3. 2 DGGE 储液 1. 1 0 0 % 变性剂, 8 % P A G 溶 液 : 200 m L 4 0 % 37. 5 : 1 的丙烯基-甲叉双丙烯酰 胺 , 400 m L 甲 酰 胺 , I O m L 50 X T A E 缓 冲 液 , 20m L 甘 油 ( 见 注 释 2 ) , 421.6 8尿 素 。缓慢加热至手温,加人搅拌棒,溶解。软 化 水 ( 如1^-以站过)加 至 I L ,室温避光保存。 2. 0 % 变性剂, 8 % P A G 溶液 : 200 m L 4〇 % 37. 5 : 1 的丙烯基-甲叉双丙烯酰胺, ' 1〇 11^50\丁八£缓冲液, 2〇 11^甘 油 ( 见 注 释 2),软 化 水 加 至 11^室 温 避 光 保存。 3. 50X T A E 溶液 : 242 g T r i s , 57. I m L 冰乙酸, 100 m L 0 . 5 m o l/L E D T A , p H 8.0。 2. 3. 3 D G G E 染色溶液 I. Cairns, 8 X 定影液: 200 m L 9 6 % 乙醇, I O m L 乙酸, 40 m L 软化水。将 50 m L Cairns’ 8 X 定影液加入350 m L 软化水中D 2•银染溶液: 4 g A g N O 3溶 于 200 m L I X Cairns’定影液。 3 . 显影液:一小称量勺 N a B H 4 (〜10 m g ), 250 m L 1.5% N a O H , 750 fxL 甲醛。 4. Cairns,保存液: 250 m L 9 6 % 乙醇, I O O m L 甘油, 650 m L 软化水。 3. 方法 D G G E 是 在 分 子 微 生 物 生 态 学 中 建 立 的 较 完 善 的 分 子 指 纹 图 谱 技 术 (11, 12)
 G G E 技术可以迅速地分析微生物群落。复杂的微 生物群落可以利用D G G E 达到可视化,理论上其 中每一条带代表一细菌种系型。然而,此技术的缺 陷 在 于 只 利 用 了 非 常 有 限 的 遗 传 信 息 (16S r R N A )。 D G G E 的原理是利用序列特异性将同样 长度的P C R 扩增产物分开。双链D N A 在变性剂的 作用下解离。 D N A 在电场中向正极移动,而变性 剂在聚丙烯酰胺凝胶中的含量也向同样方向线性增 加 ( 图 1)。电泳时P C R 产物向正极移动,在特异 性 序 列 ( 两条核苷酸链解离)决定的特定位置融 解。在扩增过程中, P C R 产 物 的 V 或 者 ^ 端 引 人 I 了 G e 夹 ,以避免完全变性,最终形成的叉状结构 ® 实质上发挥了ia止迁移的作用。染 色 后 ,可 以 在 图 I J3 g g e 的一般原理 D N A 分子在凝胶中停留迁移的位置观察到条带。 ' ' 理论上, D G G E 指纹图谱可以区分单个碱基对的差异。 3. I DNA分离 DNA 可用 Fast DNA SPIN Kit (用于土壤)( Q B IO gene, C am bs, U K ) 直接从土 壤 中 ( 或其他样本)按照说明书进行分离。这种试剂盒可高效裂解所有的微生物,包括 原来比较难处理的如细菌芽孢和内孢子、革兰氏阳性细菌、酵母、藻类、线虫和真菌。 3.2 PCR程序 下面是针对表1 的引物优化后的P C R 循环参数,选择专门对应你处理的物种适合 的程序。 1•细菌群落D G G E -P C R : 预变性 2 m i n 95〇C 变性 30 s 95 °C 杂交 40 s 56 °C 3 5 个循环 延伸 I m i n 72 °C 后延伸 5 m i n 72 °C 2 . 古细菌 D G G E -P C R : 预变性 5 m i n 94 〇 C 变性 30 s 94 °C 杂交 40 s 52 °C 3 5 个循环 延伸 60 s 68 °C 后延伸 5 m i n 68 °C

3.3 DGGE-PCR 引物 表 1 提供了一组普遍的和种群特异性的D G G E -P C R 引 物 ( 见注3.4 DGGE 3. 4 . 1 凝 肢 “三 明 治 ” 制 备 ( 见 注 释 4) 1 . 用肥皂清洗大、小玻璃板各一块,干燥后再用9 6 % 乙 醇 清 洗 ( 见 注 释 5)。 2 . 切出大小和大玻璃胶板一样的胶贴( 见 注 释 6)。 3 . 在大玻璃胶板表面上加一些水。 4 . 将胶贴的疏水面放在玻璃板上( 你可以滴一滴水在胶贴上来方便地检查疏水面
疏水面的水将滑落)。

5.用滚筒固定胶贴后移去纸保护层。

6.用纸巾轻轻吸干胶贴。

7.用 9 6 % 乙醇清洗分隔条,并放于胶贴的左右两侧。

8.将小玻璃板放在上方。

9.用夹子夹住玻璃「三明治」,并 放 人 「三明治」支架。

10.按下衬垫,并拧紧压板的螺丝。

11.将玻璃「三明治」放在橡胶密封垫上,并按下手柄。

12.用移液器加人凝胶「塞」。

3.4.2 凝 肢 「塞 」 制 备

在制备主要的分析梯度凝胶前,需 在 D G G E 玻璃板盒底部做一个〇 % 变性剂 P A G 凝 胶 「塞」 — 防止底部泄露。制备凝 胶 「塞」的主要方法如下:

1.确保凝胶架处于水平;必要时调节底部的螺丝。

2.如下制 备 「塞」溶 液(一块凝胶体积):3.5 m L 〇 % 变性剂, 8 % P A G 溶液4.5 T E M E D15 p-L 1 〇 % (W /V ) 过 硫 酸 铵(A P S )

3.通过橡胶密封垫一边加人 I m L 「塞」溶 液(见注释 7)。

4.「塞」溶液放置 lOmin。

5.灌人梯度凝胶和浓缩胶。

3.4.3 制 备 凝 肢

1.从低到高浓度梯度凝胶和浓缩胶按表 2 混合配置,操作在冰上进行(见注释 8)。

2.用软化水清洗梯度制备仪和连接管道,打 开 泵(流 速 为 19 m L /min) , 抽干系统 。

3.关闭梯度制备仪各室之间的开关。

4.用纸巾吸干各室。

5.当凝胶溶液冷却后,加 人 10% A P S 至高浓度和低浓度的变性剂溶液。

6.在右室加入高浓度溶液,在左室加入低浓度溶液。

7.开始搅拌,打开开关,并立即启动泵保持流速 4. 5 m L /min。

8.将针头放于两块玻璃板间。

9.当凝胶灌注结束后,关掉泵,转移至 Erlenmeyer 烧瓶。

10.用软化水清洗各室,启动泵抽干系统。

11.加 10% A P S 到浓缩胶中。

12.关掉各室间的开关,在右室加人浓缩胶。

13.将针头放于两块玻璃板间,启动泵,保持流速为 3 m L /min。

14.灌完浓缩胶后,插人梳子,让其凝固形成加样孔。避免气泡产生,否则会在条带中出现凹陷。15.凝胶放置聚合lh 。
3.4.4 电泳

1.在电泳槽中加人〇.5X T A E 缓冲液。

2.在电泳前至少 90m i n 打开 Dcode,以便缓冲液在 6 〇- c 达到平衡。

3.在 I h 的聚合后,轻轻拔出梳子。

4.用软化水清洗孔内和孔上未聚合的凝胶,并 轻 敲 「三明治」。

5.关掉 Dcode,打开盖子。

6.拿 出 「三明治」,放人电泳槽中。

7.打开 Dcode, 直至上缓冲室充满缓冲液。

8.关掉 Dcode, 打开盖子。

9.用充满缓冲液的注射器和针头清洗所有加样孔。

10.在加样孔中加入样品(见注释 10)。

11.盖上盖子,后打开 Dcode。

12.打开电源, 200 V 电泳 10 m i n 后,调至 85 V 再电泳 16 h。

3.5 凝 胶 染 色(见 注 释 1 1 和 12)

1.关闭电源。

2.从板上移出凝胶,放人不锈钢托盘中。

3.加入 200 m L lXCairns』固定液,摇 晃 3 min。倒出并回收利用。

4.向托盘中加入 200 m L 银 染 溶 液(注意戴手套),摇 晃 10 min。

5.弃 掉 溶 液(见注释 13)。

6.用软化水清洗托盘。

7.加人新鲜的软化水并振荡 2 min。

8.弃掉废水。

9.用软化水清洗凝胶和胶贴。

10.将凝胶放人用于盛显影液的不锈钢托盘。

11.加入少量的显影液并轻轻摇晃,弃除此部分显影液,后加入剩下的显影液。

12.摇晃至凝胶染色完全。

13.弃除显影液。

14 加入前面使用的 200 m L l X C a i r n s 』固定液至盒中,振 荡 5 min。

15.弃除固定液。

16.加人少许的软化水并振荡 2m i n。

17.用 C aims,保存液换掉软化水,振 荡 7 min。

18.胶放在玻璃板上(胶贴面朝下)。

1 9.在保存液中将大小合适的玻璃纸预湿,放在凝胶之上(见注释 14) 。

20.60°C 干燥凝胶过夜。

为了说明此方法用于复杂微生物群落在不同分类水平上具有的鉴定和比较价值,图2 和图 3 列举了在新鲜和风干的土壤中总的细菌和 BadZZzw 6enzoeworaws 相关群落的D G G E 图谱。图 2 在 Drentse A ( A ) 和 Friesian (B) 土壤样本中的总细菌和 6en2: oeTO rans的 DGGE图 谱 。条 带 通 过 克 隆 和 序 列 分 析 ,结 果 见 表 格 。泳 道 工 ,总细 菌 指 纹 图 谱 ( 通 用 DGGE引 物 GC-0968f/1401r) ; 泳 道 n , B. 相关 的 DGGE 图 谱 ( 特 异 性 引 物 REX460f/REX1466i•和 REX576f, REX1446i• ,通用 DGGE引 物 GC-0968f/1401r)(得 到 美 国 微 生 物 学 会 许 可 ,从 参 考 文 献 3 复 制 ) 。 3.6 DGGE凝胶的统计分析 D G G E 凝胶经过染色和过夜干燥后用400 D P I 分辨率扫描,并用软件如极〇 1^!11«- ics4. O (Applied M a ths B V B A ,比利时)进行分析。有很多方法用于评价D G G E 图谱 之间的相似性,主要是通过计算条带的有无或者用Pearson积差相关法比较图谱的光密 度 曲 线 等方法得到相似性指标(13, 14)。 U P G M A 算 法 可 以 在 绘 制 聚 类 树 状 图 ( 图 3b ) 分析软件中应用。多 变 量 数 据 分 析 ( 如 C A N O C ◦ 软件)也 可 用 于 D G G E 图谱分 析 ,关于其他用于分析微生物群落指纹图谱的数据分析方法在F r o m i n 等 的 文 章 (15) 中有所讨论。 4 . 注释 1 . 其他公司的聚合酶和P C R 仪也可以选用。 .2.只有在银染的时候才加甘油。 ; 其他染色无需加入。 3. G C 夹可以连到上游和下游引物,但是通常连到5 '端 。 4 . 注意 :在 D G G E 凝胶的电泳和显影过程中所用的是高毒和致癌物质。使用时佩
图 3 不同地点土壤中B. ferazoetwram相 关 群 落 的 DGGE图 谱 ( a) 和对应的类树状图 (UPGM A聚类)( b )。 M , 分子质量标准; I, Wageningen大 学 试 验 田 ( 荷兰) ; 2, Rhine 河 边 ( 荷兰) ; 3, Drentse A (荷兰) ; 4, Friesland (荷兰) ; 5, 普通赤杨 结 节 ( 荷兰) ; 6, 普通赤杨根围( 荷兰) ; 7 , 河 边 ( 葡萄牙) ; 8 , 草 地 ( 葡萄牙) ; 9, 松树 林 ( 葡萄牙) ; 1 0 , 果 园 ( 葡萄牙) ; 11,蔬 菜 园 ( 葡萄牙) ; I2 , 喜马拉雅山,土壤团块; 1 3 , 喜马拉雅山,马 桑 ( CoWaWa 心 )根 围 土 壤 ( 得到美国微生物学会许可,从参 考文献3 复制) 。 戴手套,而且当被污染时,及时更换。 5. 玻璃板的仔细清洗对凝胶配制非常关键,油脂点会导致聚丙烯酰胺凝胶表面 扭曲。 6. 胶贴如果比大玻璃板还大则无法制备凝胶。 7. 避免出现气泡。 8. 使用通风柜。 9. 将空的三明治( 没有分隔条)放在盒架的另一边,构成一个封闭上缓冲室。 10. 记住上样是按照镜面方向。 11•按照Sanguinetti等 (1 6 ) 稍作修改。 12. 凝胶也可以用S Y B R G O L D 或 E B 染色。 13. 步 骤 5〜8 的溶液按化学废弃物处理。 M . 避免气泡;将凝胶边缘按到玻璃板上


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