RNAi基因沉默方法

大约在十年前，2006年诺贝尔生理/医学奖得主CraigMello和AndrewFire发现，他们能够将短RNA 分子插入到线虫中并沉默特定基因的表达。今天，研究人员也常常使用这种强大的RNA 干扰方法来研究哺乳动物系统中的特定基因功能。

为了进行这种基因沉默实验，研究人员通常需要依赖化学合成的RNA 分子，而这个合成过程是相当昂贵的。本月《冷泉港实验手册》（ColdSpringHarborProtocols）上的一篇免费文章就这个问题进行了讨论。该文章描述了一种能产生沉默RNA （esiRNA ）以有效靶向哺乳动物细胞中的任何基因的很划算的方法。

这篇文章描述了如何在体外利用酶合成RNA 分子，该方法利用克隆的感兴趣基因作为模版。接着，这些RNA 分子被随机分割成短的片段，纯化后用于RNA 干扰实验。

这种方法是由德国马克思・普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所的FrankBuchholz研究组发明，能够用于制备大的esiRNA 库以用于大规模的基因功能研究。

本月《冷泉港实验手册》中另外一篇重点文章还描述了如何利用胎鼠培养胸腺细胞。胸腺是脊椎动物免疫系统的重要组成部分――T细胞的发源地。胎鼠胸腺器官培养是体外研究T细胞成熟过程的唯一可利用系统，并且这种操作方法将能帮助希望了解T细胞成熟机制的研究人员。该文章的作者是英国伯明翰大学MRC免疫调节研究中心的GrahamAnderson和EricJ.Jenkinson撰写。

最新发布的这个实验手册的文章还包括成像斑马鱼的神经元活动、分析果蝇和青蛙的基因表达模式、制备用于基因分型研究的哺乳动物DNA和鉴定蛋白质相互作用的文章。

RNA i现象的发现，加速了后基因组时代基因功能的研究步伐，更重要的是，RNA i自身可以应用于临床治疗，有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。美国《科学》(Science)杂志连续三年将其评为十大科学突破之一，并于2002年将其评为十大科学突破之首。

科学家公认，RNA i的研究将是未来十年生物医药研究中最激动人心也最有可能产生丰富成果的领域之一。在提出后短短几年，RNA i这一项举世瞩目的技术得到诺贝尔奖的青睐和肯定，其发现者Dr.AndrewFire和Dr.CraigMello获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。

RNA i是在研究秀丽新小杆线虫（C.elegans）反义RNA （antisenseRNA ）的过程中发现的，由dsRNA 介导的同源RNA 降解过程。1995年，Guo等发现注射正义RNA （senseRNA ）和反义RNA 均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA 技术的理论做出合理解释。直到1998年，克雷格・梅洛博士和卡耐基研究院的Dr.AndrewFire证实Guo等发现的正义RNA 抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA 中污染了微量dsRNA 而引发，并将这一现象命名为RNA i。

此后dsRNA 介导的RNA i现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA 介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNA i在不同物种的表现形式。

1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA 中间产物。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA 通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA （smallinterferingRNA ，siRNA ）引发RNA i。

2000年，Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA 能引发RNA i效应。2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA 可在避免激活dsRNA 依赖的蛋白激酶(dsRNA -dependentproteinkinase，PKR)和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylatesynthetase，2',5'-OAS)信号转导途径的同时，有效抑制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。

2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA （smallhairpinRNA ，shRNA ）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNA i技术进行基因治疗研究奠定了基础。