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RNA实验

采用PACE分析RNA-肽相互作用实验

RNA
2024-06-14 RNA实验 加入收藏
原理聚丙烯酰胺共电泳(poiyacrylamide coelectrophuresis,PACE ) 检测是相对较晚发展起来的定量分析蛋白质、肽与 DNA 或


原理

聚丙烯酰胺共电泳(poiyacrylamide coelectrophuresis,PACE ) 检测是相对较晚发展起来的定量分析蛋白质、肽与 DNA 或 RNA 相互作用的方法。

材料与仪器

低放射性标记物 RNA 底物
TBE 凝胶储存缓冲液 电泳缓冲液 丙烯酰胺储存液 过硫酸铵 考马斯亮蓝
聚丙烯酰胺凝胶电泳设备 PACE 凝胶 层析纸 塑料膜 凝胶干燥器 暗盒

步骤

一、材料与设备

1. 标准聚丙烯酰胺凝胶电泳设备,包括电源、电泳槽、夹子、热槽(1/8 英寸厚的铝板)。

2. 宽而短的凝胶,因为宽的凝胶可以包含更多的浓度梯度,短的凝胶可以减少每个聚丙烯酰胺条需要的肽量,一般尺寸为 24 cm X 36 cm 或 26 cm X 36 cm( h X w ),凝胶的实际尺寸并不是至关重要的,在具体应用时这个操作程序同样可以在其他尺寸的凝胶应用。

3. 针对 PACE 凝胶,梳子和垫片要进行一定的切割,如图 11.5 所描述对梳子和垫片进行切割,切割以后的凝胶可以包括 10 个肽浓度。



4. 10 ml Luer 注射器,25 gage 针头,手套和石蜡膜。

5. 低放射性标记物。

6. 层析纸,塑料膜和凝胶干燥器。

7. 暗盒,X 射线片和显影剂。

8. 放射物质定量仪器。

9. 5X TBE 凝胶储存缓冲液和电泳缓冲液:450 mmol/L Tris 碱,450 mmol/L 硼酸,10 mmol/L EDTA(pH 8.0)。

10. 40% 丙烯酰胺储存液(29:1,丙烯酰胺:甲叉甲双丙烯酰胺)。

11. 10% 过硫酸铵(API 水溶液(m/V),99% TEMED。

12. 32P 标记的 RNA 底物,PACE 可以使用 3',5' 或者内部标记的 RNA。可以采用标准的程序制备 RNA 样品,如果仅有痕量浓度的 RNA 上样到 PACE 凝胶,则要求高的放射活性(> 200 dμm/fmol)。

13. 制备并纯化肽或者蛋白。因为 PACE 测定非常敏感,高纯度和精确浓度的肽是最基本的要求,一般采用反向高效液相色谱(PR-HPLC)或其他的高精度的纯化方法进行纯化,蛋白或肽溶液要用水或合适的储存缓冲液进行系列稀释。储存液通常配制为 100X,在使用时稀释 100 倍。

14. RNA 样品稀释到 6X 的 Ⅲ 型上样染料中:0.24% 溴酚蓝,0.24% 的二甲苯青 FF,30% 的甘油水溶液。

15. 考马斯亮蓝蛋白染色:0.24% 考马斯亮蓝,45% 甲酵的 10% 冰醋酸水溶液,用来标定 PACE 电泳的时间。

二、试验方法

1. 检测

(1) 用去污剂仔细清洗每个凝胶板并用水冲干净,然后再用乙醇淋洗,理想硅化板可以保证灌注后凝胶混合物均匀分布。如图 11.6 所示安装凝胶板、梳子和垫片,将其旋转 90°。滑动取出上部的垫片(S)创造一个灌胶的空隙,在 B 和 P 相对的毎个缺口的顶部之间画线,标定每个肽浓度凝胶的灌注高度,标记每个道并记录所使用的肽储存液浓度。



(2) 制备 200 ml 凝胶混合物:0.5X TBE,15% ( 29:1)丙烯酰胺,0.02% 的过硫酸铵(20 ml 5X TBE 储存液,75 ml 40% 的丙烯酰胺储疗液,400 μl 10% 的 AP,104.6 ml 重蒸水)。使用时添加盐(Na+,K+,Mg2+ 等)、去污剂或其他缓冲液成分到合适的终浓度。为了快速完全聚合,使用真空抽气机进行脱气,直到不强烈的产生气泡。如果使用去污剂,要在脱气以后加入,凝胶混合物终体积为 200 ml。

(3) 去除注射器的活塞,用石蜡膜封住针筒下部的孔并保持竖直,加入 70.7 μl 100X 肽储存液(或缓冲液,在肽浓度为 0 的凝胶条使用),加入 7 ml 的凝胶混合物,14 μl 的 TEMED,用手指紧紧的封住针筒的末端,将活塞轻轻地推回到针筒的适当位置,将注射器倒转使针孔向上,让气泡升到上部,移开手指和石蜡膜,不要将注射器指向自己,因为可能会有少量的凝胶混合物喷出,推动活塞直到它完全进入针筒内,然后再堵住针孔。反复颠倒注射器数次以便混匀凝胶混含物,移幵手指推动活塞使气体溢出针筒,直到凝胶混合物刚好要溢出。

(4) 安装 21 gage 针头,缓慢的将凝胶从装置的顶部空隙灌注到两个玻璃板之间,直到凝胶达到第一个切口之间的画线。

(5) 等待 10 min 以便凝胶进行聚合,在等待的同时,取出注射器,丢弃剩余的混合液到适当的容器。用蒸馏水洗涤注射器和针头以便下一次使用,注意要确保没有残留的水。

(6) 凝胶聚合完成后,用一条宽度刚好能够插入到玻璃板之间的 Whatman 纸在两个板中间滑动,吸出上层的未聚合的凝胶溶液。

(7) 重复步骤 (4)~(6),依次改变凝胶中肽的浓度灌注标号为 1~8 的凝胶条。

(8) 减少凝胶底部与垫片 S 之间的空隙并灌注最后的凝胶条( 标号为 9)。倾斜装置,以使凝胶溶液流向底部的灌胶梳子,等 10 min 以便凝胶聚合。

(9) 如图 11.7 将装置放平,在灌胶梳子一端稍抬起(大约 5 cm)。去除凝胶梳子,用 Whatman 纸将剩余的未聚合凝胶吸除干净。



(10) 配制 7 ml 肽浓度为 0 的凝胶混合物,加入 14 μl TEMED,然后灌胶直到凝胶混合物到达顶部板的边缘,再加入 1 ml TEMED,插入梳子,聚合 15 min。

(11) 去除底部的垫片及梳子,将灌好的胶装到电泳槽。

(12) 在电泳槽中加入 0.5% TBE 缓冲液(添加盐或去污剂),洗涤上样孔和去除底部垫片后的空隙,不必进行预电冰,将 RNA 样品加到适当的上样孔,上样孔一般只能上 2 μl 的样品。

(13) 凝胶应该在恒定的低电压下进行电泳,以尽量减少热的产生,21 cm X 36 cm 大小,0.8 mm 厚的凝胶在 3W 的条件下(不考虑盐的浓度)可以得到好的分离效果,电泳的吋间控制在 RNA 和肽刚好不跑出凝胶。

(14) 电泳结束后取下凝胶装置,移去一块电泳玻璃板,用塑钭膜盖住凝胶,在塑料膜上标记每个泳道的肽浓度,将凝胶从另一个板上剥离,转移到塑料膜上,用 Whatman 纸覆盖凝胶。

(15) 在凝胶干燥器里干燥 1 h,粘上两点发光的标签作为参照,凝胶对底片曝光适当的时间。

(16) 进行底片显影,使其干燥,利用发光标签将凝胶和底片对齐,在含肽的区域和加样孔区域的交界面做标记,测量从该处到每个条带中央的距离,或者是到条带底部的距离 ( 条带有拖影或者跨越了两个道的分界时),重要的是在一个试验中要采用一致的测量方法。


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