采用RNA聚合酶Ⅲ启动子表达siRNA分子
原理因为哺乳动物细胞不具备低等真核生物细胞所具有的扩增 RNAi 信号的机制，因此人工合成或体外转录的 siRNA 分子在细胞内的作用是瞬时性的，不适合用于进行
原理
因为哺乳动物细胞不具备低等真核生物细胞所具有的扩增 RNAi 信号的机制，因此人工合成或体外转录的 siRNA 分子在细胞内的作用是瞬时性的，不适合用于进行靶基因的表达受到抑制后细胞表型的长期变化观察，也不适于进行文库的筛选。此外，体外制备 siRNA 分子的成本比较高，而且 siRNA 分子在体外易被 RNase 降解，操作相对比较复杂，这就限制了他们的应用。新近，Brummelkamp、Miyagishi 等采用 RNA 聚合酶 Ⅲ 的启动子（U6 和 H1）在哺乳动物细胞中表达 siRNA 分子，成功地抑制了靶基因的表达，为在哺乳动物细胞中长期研究对特异性基因的抑制打下了基础。如果将 siRNA 分子表达盒（casseue) 插入腺病毒或反转录病毒载体中，就可以通过特异性地抑制机体中特定致病基因的表达来达到基因治疗的目的。
材料与仪器
siRNA表达载体 DNA寡聚核苷酸 限制性内切核酸酶 T4 DNA连接酶 U6 或 H1 启动子片段 Taq DNA 聚合酶
退火缓冲液
DNA 凝胶回收试剂盒 PCR 产物回收试剂盒 PCR 扩增仪
退火缓冲液
DNA 凝胶回收试剂盒 PCR 产物回收试剂盒 PCR 扩增仪
步骤
一、材料与设备
1. siRNA 表达载体（含 U6 或 H1 启动子）。
2. 人工合成的 DNA 寡聚核苷酸。
3. 限制性内切核酸酶。
4. T4 DNA 连接酶。
5. DNA 凝胶回收试剂盒。
6. 2X 退火缓冲液（200 nmol/L KAc，4 mmol/L MgAc，60 mmol/L Hepes-KOH， pH 7.4 )。
7. U6 或 H1 启动子片段。
8. Taq DNA 聚合酶。
9. PCR 产物回收试剂盒。
10. PCR 扩增仪。
二、操作方法
1. 载体表达法
(1) 根据所选定基因的靶序列，设计并合成两条互补的 DNA 寡聚核苷酸，具体的设计要依据表达的分子是发夹式 siRNA 分子或正义与反义 RNA 单链的不同而不同。
同时在寡核苷酸的两端均应包含适当的酶切位点，以便在互补的两条链退火形成双链后能在其两侧产生合适的酶切位点的未端，便于后续的克隆。
(2) 用适量的无菌双蒸水溶解人工合成的 DNA 寡梭苷酸。
(3) 在 2X 退火缓冲液中加入适量的无菌水和人工合成的寡核苷酸模板，使两条 DNA 链的终浓度均为 20 mmol/L，将上述混合液置于 90℃ 变性 1 min，然后再置于 37℃ 温育 1 h。在反应液中加入 1/3 体积的 NH4Ac 和两倍体积的无水乙醇，置 -20℃ 30 min，然后于 4℃ 12000 r/mm 离心 10 min以回收核酸。
(4) 取 siRNA 表达载体（含 U6 或 H1 启动子）经合适的酶切，再经琼脂糖凝胶电泳回收，然后与步骤 ( 3 ) 中回收的双链核酸在 T4 DNA 连接酶的作用下连接，将获得的阳性重组克隆进行测序以确定插入片段的正确性。在克隆的过程中应尽量保证表达 siRNA 分子的模板的第一位碱基与 U6 或 H1 启动子的转录起始位点相同。
(5) 取适量的阳性重组质粒在核酸转染试剂如 Lipofectaminc 2000 的介导下转染实验用细胞，然后可以在 48 h 后观察靶基因的瞬时抑制效果，也可以依据表达栽体中含有的稳定筛选标志 ( 如 Neomycine 抗性基因），采用特定的抗生素（如 G418）进行筛选，获得稳定的克隆细胞株后再观察靶基因表达抑制后的长期效应。
2. PCR 方法
(1) 设计 U6 或 H1 启动子启动 PCR 扩增的 5' 端引物，并依据表达 siRNA 分子的不同（表达发夹式 siRNA 分子或分別表达组成 siRNA 分子的两条单链）设计不同的 3' 端 PCR 扩增引物。当在细胞中表达发夹式 siRNA 分子时，其 3' 端引物包括与 U6 启动子 3' 端互补的序列（20 nt）、靶位点的正义链序列、loop 环序列、靶位点的反义链序列、连续的 5 个 A ( U6 启动子的转录终止信导，其后的序列将不被转录）以及附加的适当的酶切位点（便于后续的克隆）；如果需要在细胞中分别表达 siRNA 分子的正义与反义 RNA 单链时，釆用的 3' 端引物包含与 U6 启动子 3' '端互补的序列和靶序列的正义或反义链（19 nt），在它们的 3' 端为连续的 5 个 A 和附加的适当的酶切位点。
(2) 在细胞中分別表达 siRNA 分子的正义与反义链时，使 5‘ 端引物分別与表达正义与反义单链的 3' 端引物配对进行 PCR 扩增，将获得的正义与反义链分别纯化后即可以在核酸转染试剂如 Lipofecta -mine 2000 的介导下转染靶细胞。在细胞中， RNA 聚合酶Ⅲ 可以分别以两条 PCR 产物为模板转录合成 siRNA 分子的两条单链，它们在细胞中再退火形成双链的分子。
(3) 如果要在细胞中表达发夹式的 siRNA 分子，使 5' 端引物与对应的 3' 端引物配对进行 PCR 扩增。将获得的 PCR 产物纯化回收后即可以在核酸转染试剂的介导下转染靶细胞。虽然采用的 3' 端引物相对比较长，而且容易形成二级结构，在 PCR 扩增的时候容易引起麻烦，但这种方法相对比较简单，操作步骤较少，而且可以避免多次 PCR 扩增过程中引入的序列突变。
(4) 对于那些通过瞬时转染筛选获得的对靶基因有较好抑制效果的 siRNA 分子，可以通过利用在 PCR 引物中引入的酶切位点将表达这些 siRNA 分子的 PCR 产物克隆到含有稳定筛选标志（如 Neomycine 抗性基因）的载体中，并通过相应的抗生素（如 G418 ) 筛选获得稳定表达的细胞株，由此可以观察抑制靶基因表达后细胞表型变化的长期效应。
1. siRNA 表达载体（含 U6 或 H1 启动子）。
2. 人工合成的 DNA 寡聚核苷酸。
3. 限制性内切核酸酶。
4. T4 DNA 连接酶。
5. DNA 凝胶回收试剂盒。
6. 2X 退火缓冲液（200 nmol/L KAc，4 mmol/L MgAc，60 mmol/L Hepes-KOH， pH 7.4 )。
7. U6 或 H1 启动子片段。
8. Taq DNA 聚合酶。
9. PCR 产物回收试剂盒。
10. PCR 扩增仪。
二、操作方法
1. 载体表达法
(1) 根据所选定基因的靶序列，设计并合成两条互补的 DNA 寡聚核苷酸，具体的设计要依据表达的分子是发夹式 siRNA 分子或正义与反义 RNA 单链的不同而不同。
同时在寡核苷酸的两端均应包含适当的酶切位点，以便在互补的两条链退火形成双链后能在其两侧产生合适的酶切位点的未端，便于后续的克隆。
(2) 用适量的无菌双蒸水溶解人工合成的 DNA 寡梭苷酸。
(3) 在 2X 退火缓冲液中加入适量的无菌水和人工合成的寡核苷酸模板，使两条 DNA 链的终浓度均为 20 mmol/L，将上述混合液置于 90℃ 变性 1 min，然后再置于 37℃ 温育 1 h。在反应液中加入 1/3 体积的 NH4Ac 和两倍体积的无水乙醇，置 -20℃ 30 min，然后于 4℃ 12000 r/mm 离心 10 min以回收核酸。
(4) 取 siRNA 表达载体（含 U6 或 H1 启动子）经合适的酶切，再经琼脂糖凝胶电泳回收，然后与步骤 ( 3 ) 中回收的双链核酸在 T4 DNA 连接酶的作用下连接，将获得的阳性重组克隆进行测序以确定插入片段的正确性。在克隆的过程中应尽量保证表达 siRNA 分子的模板的第一位碱基与 U6 或 H1 启动子的转录起始位点相同。
(5) 取适量的阳性重组质粒在核酸转染试剂如 Lipofectaminc 2000 的介导下转染实验用细胞，然后可以在 48 h 后观察靶基因的瞬时抑制效果，也可以依据表达栽体中含有的稳定筛选标志 ( 如 Neomycine 抗性基因），采用特定的抗生素（如 G418）进行筛选，获得稳定的克隆细胞株后再观察靶基因表达抑制后的长期效应。
2. PCR 方法
(1) 设计 U6 或 H1 启动子启动 PCR 扩增的 5' 端引物，并依据表达 siRNA 分子的不同（表达发夹式 siRNA 分子或分別表达组成 siRNA 分子的两条单链）设计不同的 3' 端 PCR 扩增引物。当在细胞中表达发夹式 siRNA 分子时，其 3' 端引物包括与 U6 启动子 3' 端互补的序列（20 nt）、靶位点的正义链序列、loop 环序列、靶位点的反义链序列、连续的 5 个 A ( U6 启动子的转录终止信导，其后的序列将不被转录）以及附加的适当的酶切位点（便于后续的克隆）；如果需要在细胞中分别表达 siRNA 分子的正义与反义 RNA 单链时，釆用的 3' 端引物包含与 U6 启动子 3' '端互补的序列和靶序列的正义或反义链（19 nt），在它们的 3' 端为连续的 5 个 A 和附加的适当的酶切位点。
(2) 在细胞中分別表达 siRNA 分子的正义与反义链时，使 5‘ 端引物分別与表达正义与反义单链的 3' 端引物配对进行 PCR 扩增，将获得的正义与反义链分别纯化后即可以在核酸转染试剂如 Lipofecta -mine 2000 的介导下转染靶细胞。在细胞中， RNA 聚合酶Ⅲ 可以分别以两条 PCR 产物为模板转录合成 siRNA 分子的两条单链，它们在细胞中再退火形成双链的分子。
(3) 如果要在细胞中表达发夹式的 siRNA 分子，使 5' 端引物与对应的 3' 端引物配对进行 PCR 扩增。将获得的 PCR 产物纯化回收后即可以在核酸转染试剂的介导下转染靶细胞。虽然采用的 3' 端引物相对比较长，而且容易形成二级结构，在 PCR 扩增的时候容易引起麻烦，但这种方法相对比较简单，操作步骤较少，而且可以避免多次 PCR 扩增过程中引入的序列突变。
(4) 对于那些通过瞬时转染筛选获得的对靶基因有较好抑制效果的 siRNA 分子，可以通过利用在 PCR 引物中引入的酶切位点将表达这些 siRNA 分子的 PCR 产物克隆到含有稳定筛选标志（如 Neomycine 抗性基因）的载体中，并通过相应的抗生素（如 G418 ) 筛选获得稳定表达的细胞株，由此可以观察抑制靶基因表达后细胞表型变化的长期效应。
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