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RNA实验

miRNA克隆实验

2024-06-14 RNA实验 加入收藏
原理在细胞中表达的 RNA 除了我们所熟悉的 mRNA 以外,还有大量不编码蛋白质的非编码 RNA(noncoding RNA,ncRNA),非编码 RNA 在


原理

在细胞中表达的 RNA 除了我们所熟悉的 mRNA 以外,还有大量不编码蛋白质的非编码 RNA(noncoding RNA,ncRNA),非编码 RNA 在细胞中起着非常重要的作用,如 rRNA 和 tRNA 维持着基因的表达,还有一部分则起着调控基因表达的作用。

材料与仪器

寡核苷酸 乙腈 ImpA p17.91X DEPC 糖原 T4 RNA 连接酶 反转录酶 dNTP DTT EDTA T4 DNA 连接酶 BanⅠ限制性内切核酸酶 Taq 酶 M13F 引物 M13R 引物
混合液 沉淀液 上样液 乙醇 T4 RNA 连接酶缓冲液 重蒸水 KOH Tris-HCl T4 RNA 连接酶缓冲液 NEB 缓冲液 溶胶溶液
TOPO TA 克隆试剂盒

步骤

一、材料与设备

1. 寡核苷酸。

2. 乙腈。

3. 混合液 A:0.5 mmol AMP(5' 磷酸化)溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。

4. 混合液 B:1 mmol 三苯磷,1 mmol 2,2'- 双吡啶二硫化物,2.5 mmol 咪唑,0.90 ml 三乙胺,溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。

5. 沉淀液:9 mmol NaClO4,225 ml 丙酮,115 ml 乙醚 ( 无水乙醚)。

6. 25 mmol MgCl2

7. 50 mmol/L ImpA ( ImpA 合成见操作方法第2部分)。

8. 0.2 mmol/L p17.91X ( 见操作方法第1部分,即 3' 末端封闭的 3' 端供体寡核苷酸)。

9. 上样液:8 mol/L 尿素,0.5 mmol/L EDTA。

10. 乙醇。

11. DEPC。

12. 糖原。

13. 5X T4 RNA 连接酶缓冲液:250 mmol/L Hepes ( pH 8.3 ),50 mmol/L MgCl2, 16.5 mmnol/L DTT,30 μg/ml BSA,41.5% 甘油。

14. T4 RNA 连接酶。

15. 反转录酶(invitrogen superscript RT)。

16. 重蒸水。

17. 10X dNTP( 1X dNTP 含有每种 dNTP 各 0.2 mmol/L)。

18. 100 mmol/L DTT。

19. 0.1 mol/L EDTA。

20. 1 mol/L KOH。

21. 1 mol/L Tris-HCl ( pH 1.0 )。

22. 0.2 mol/L MgCl2

23. T4 DNA 连接酶。

24. 5X T4 RNA 连接酶缓冲液:250 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 ),50 mmol/L MgCl2,50 mmol/L DTT,5 mmol/L ATP,125 μg/ml BSA。

25. BanⅠ限制性内切核酸酶。

26. 10X NEB 缓冲液 4:500 mmol/L 乙酸钾,200 mmol/L Tris-HAc,100 mmol/L 乙酸镁,10 mmoI/L DTT。

27. 溶胶溶液:20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,0.1 mmol/L EDTA pH 8.0。

28. TOPO TA 克隆试剂盒。

29. Taq 酶。

30. M13F 引物:5' GGTAACGCCAGGGTTTTCC 3'。

31. M13R 引物:5' CAGGAAACAGCTATGACC 3'。

32. 1X 上样液:8 mol/L 尿素,0.5 mol/L EDTA。

二、操作方法

1. 寡核苷酸设计

(1) 用于 RNA 克隆的寡核苷酸(下划线部分为 BanⅠ酶切位点 G↓GYRCC):

3' 端供体寡核苷酸:17, 91-pCTGTAGGCACCTCAAx(x:DMT-O-C3-CPG)。

5' 端受体寡核苷酸:17.93R ATCGTaggcacctgaaa(小写部分为 RNA,大写部分为 DNA)。

3' 端反转录引物:15.22-ATTGATGGTGCCTAC。

5' 端 PCR 引物:17.93D-ATCGTAGGCACCTGAAA。

3' 端 PCR 引物:17.92-ATTGATGGTGCCTACAG。

(2) 18 和 24 碱基 RNA Marker 转录序列:

T7 启动子可转录 24 个碱基的序列(斜体是 T7 启动子)。

44.12D:TCACTATTGTTGAGAACGTTGGCCTATAGTGAGTCGTATTACGC,从 44.12D 转录来的 RNA Marker(有 AclⅠ酶切位点)。

44.12R:GGCCAACGUUCUCAACAACAAUAGUGA。

 从 Dharmacon 购买的 RNA Marker(含有 BamHⅠ酶切位点)。

18.113:AGCGUGUAGGGAUCCAAA。

2. ImpA 的合成

(1) 合成。合成 ImpA 的材料可从 Sigma 公司购买,要求纯度至少达到 99%,混合物 A 和混合物 B 用无水的烧杯盛装,将 A 缓慢地与 B 搅拌混合,开始时两种混合物不相溶,但当反应颜色转变为黄绿色的时候,固体物开始溶解,在烧杯底部出现的油状物最终也会溶解。室温搅拌 1~1.5 h。

(2) 纯化。一滴滴加入沉淀液,ImpA 开始析出,留 60 ml 液体供分析用。把沉淀转到离心管中,用丙酮洗余下的沉淀,5000 r/min 离心 10 min,倒出丙酮,用丙酮再洗 2 次。最后用乙醚洗,3000 g 离心 20 min,22.5~45℃ 之间真空干燥过夜,然后放在小瓶中 -20℃ 储存。

(3) 分析。称量合成物的重量。用 10 倍体积的饱和 (NH4)2SO预浸泡纤维素,然后干燥以进行纤维素薄层色谱分析。用水溶解 AMP 和 ImPA。分别将混合物 A、ImpA、混合物 B、纯化步骤中的留样液体、水溶解的 AMP 进行点样。用 80% 乙醇做展开液,展开 9 cm,AMP 最慢,ImpA 其次,混合物 B 和剩余物在最前端。用手提紫外灯观察。

3. 寡核苷酸的合成

所有的引物都用 Biosystems 公司的 8900 DNA 合成仪合成。

4. 放射性标记 RNA marker 的制备

体外转录 44.12D 获得 RNA Marker 44.12R。 用 32P 标记 RNA Marker 18.113 和 44.12R,再加 20% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,回收获得放射性标记的 18 和 24 碱基 RNA Marker(操作方法见相关章节)。

5. 寡核苷酸的腺苷酰化作用 1x 的合成

500 μl 反应体系中含 25 mmol MgCl2,50 mmol/L ImpA,0.2 mmol/L 17.91x。50℃ 孵育 3 h,20% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,胶厚度是 1.5 mm,上样孔为 23 mm 宽。电泳,切胶,用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜,再用 2 倍体积的乙醇 -20℃ 沉淀至少一个小时,12000 g 离心 20 min,弃去上清,晾干沉淀,用蒸馏水溶解沉淀。得到的终产物 App 17.91x,可以在 -80°C 条件下保存数月。

6. 微 RNA 提纯

15% 变性聚丙烯酰胺胶,样孔宽 23 mm , 先进行预电泳处理,然后把提取的总 RNA 和痕量的高灵敏放射性标记的 RNA marker(放射性标记的 18.113 和 44.12R)以及 1 倍体积的上样液混合,80℃ 加热 5 min,上样,电泳,直至指示剂染料电泳到电泳槽底部,把胶取下,放射自显影,将放射标记物之间的部分从胶上切下,用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜,再用 2 倍体积的乙醇沉淀,离心后重悬于 10~20 μl DEPC 处理过的水中。

7. 微 RNA 3' 端接头的连接

3' 端连接反应体系如下:5X RNA 连接缓冲液 2 μl,200 μmol/L App 17.91x 2 μl,T4 RNA 连接酶 1 μl,微 RNA、同位素标记的 RNA Marker 5 μl,总体积 10 μl。

室温反应 2~6 h 后用 10 μl 2X 上样液终止反应。用 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用放射性标记 Marker,从胶上把 35~43 个碱基之间的部分切下,用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜,再用 2 倍体积的乙醇沉淀,最后溶解于 10~20 μl DEPC 处理过的水中。

8. 微 RNA 5' 端接头的连接

5' 端连接反应体系如下: 5X RNA 连接缓冲液 2 μl,200 μmol/L App 17.93R 2 μl,4 mmol/L ATP 1 μl,T4 RNA 连接酶 1 μl,微RNA 3' 端连接反应产物 5 μl,总体积 10 μl。

室温反应 2~6 h 后用 10 μl 2X 上样液终止反应。与 3' 端纯化用相同的方法,最终获得 52~60 个碱基的混合物,重悬于 10~20 μl DEPC 处理过的水中保存。

9. 连接产物微 RNA 的 RT-PCR

反应体系如下:RNA 连接产物 5 μl,100 μmol/L 15.22 3 μl,dH2O 5 μl,

混合后,30°C 加热 2 min,然后继续加入:

5X 反转录缓冲液 5 μl,10X dNTP 7 μl,100 mmol/L DTT 3 μl,Superscript Ⅱ 反转录酶 3 μl。

在加入反转录酶之前,先在 48 ℃ 预热 3 min,从总体积中取出 2 μl 做对照。所有试剂都加完后,在 48℃ 孵育 1 h,然后加入 1 μl 0.1 mol/L EDTA 和 3.8 μl 1 mol/L KOH,90℃ 加热 10 min,除去所有 RNA,然后用 4 μl 1 mol/L TriS-HCl pH 1.0 和 1 μl 0.2 mol/L MgCl中和反应。所有的RT反应产物都用于 PCR 扩增。

PCR 反应体系如下:反转录产物 5 μl,10X PCR 缓冲液 10 μl,10X dNTP 10 μl,100 μmol/L 17.92 1 μl,100 μmol/L 17.93D 1 μl,Taq 酶 2 μl,dH2O 71 μl,总体积 100 μl。

94°C 1 min,50°C 1 min,72℃ 1 min,扩增 20~25 个循环。

15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,用 SYBR Gold ( 购于 Molecular Dynamics 公司) 染色。先用苯酚抽提 2 次,再用氯仿抽提 2 次,取水相,加入 NaCl 至 0.3 mol/L,用乙醇沉淀 PCR 扩增产物,最后溶解到 40 μl 中水。

10. PCR 产物的连接

用 BanⅠ消化 PCR 产物,反应用酶及其缓冲液购自于纽英伦生物技术有限公司。反应体系如下:PCR 产物 40 μl,NE 缓冲4 30 μl,BanⅠ20 U/μl 10 μl,dH2O 220 μl,总体积 300 μl。

37°C 反应 4 h。取 15 μl 用 15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,用 1 μl PCR 产物和 10 bp DNA ladder 做标准对照。用 SYBR Gold 染色。产物用酚和氯仿各抽提 2 次,加入 NaCl 至 0.3 mol/L,再用乙醇沉淀 BanⅠ消化的 PCR 产物。在沉淀中加入下列试剂,进行连接反应:H2O 8 μl,10X T4 DNA 连接酶缓冲液 1 μl,T4 DNA 连接酶 1 μl。

室温反应 30 min。琼脂糖电泳,用 100 bp DNA Marker 做标准。从胶上将大于 300 bp 的片段切下来,加 10 倍体积的溶胶液,65°C 放置 5 min,将融化的胶分到多个离心管中,加等体积的酚,振荡 20 s,冰浴 5 min,于 4℃ 5000 g 离心 10 min,移取水相,用苯酚:氯仿(1:1)混合物再抽提,最后用氯仿抽提。加 0.06 倍体积的 5 mol/L NaCl 和 2.5 倍体积的乙醇,-20℃ 沉淀 2 h 以上。

11. PCR 连接产物与 TOPO 载体的连接

将上步的沉淀溶解在以下的体系中:H2O 11.5 μl,10X PCR 缓冲液 1.5 μl,10X dNTP 1.5 μl,Taq 酶 0.5 μl。

72℃ 反应 5 min。取 5 μl 用于与 TOPO 载体连接。所有的连接产物都用于转化。在转化了的感受态菌中加 500 μl SOC 培养基,于 37℃ 培养 45 min,分別用 75 μl、150 μl、300 μl 涂氨芐抗性平板,37°C 生长过夜。

12. 筛选及测序

挑取白色克隆,划平板,生长过夜,用 PCR 筛选,PCR 反应体系如下:10X PCR 缓冲液 3 μl,10X dNTP 3 μl,100 μmol/L M13F 0.2 μl,100 μmol/L M13R 0.2 μl,Taq 酶 0.5 μl,dH2O 23 μl,总体积 30 μl。

94°C 3 min,94°C 40 s,50°C 40 s,72°C 40 s,进行 25 个循环。琼脂糖凝胶电泳检测,选择包含约为 500~800 bp 插入序列的克隆进行测序。采用生物信息学方法对序列进行分析。



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