miRNA克隆实验
原理在细胞中表达的 RNA 除了我们所熟悉的 mRNA 以外，还有大量不编码蛋白质的非编码 RNA（noncoding RNA，ncRNA），非编码 RNA 在
原理
在细胞中表达的 RNA 除了我们所熟悉的 mRNA 以外，还有大量不编码蛋白质的非编码 RNA（noncoding RNA，ncRNA），非编码 RNA 在细胞中起着非常重要的作用，如 rRNA 和 tRNA 维持着基因的表达，还有一部分则起着调控基因表达的作用。
材料与仪器
寡核苷酸 乙腈 ImpA p17.91X DEPC 糖原 T4 RNA 连接酶 反转录酶 dNTP DTT EDTA T4 DNA 连接酶 BanⅠ限制性内切核酸酶 Taq 酶 M13F 引物 M13R 引物
混合液 沉淀液 上样液 乙醇 T4 RNA 连接酶缓冲液 重蒸水 KOH Tris-HCl T4 RNA 连接酶缓冲液 NEB 缓冲液 溶胶溶液
TOPO TA 克隆试剂盒
混合液 沉淀液 上样液 乙醇 T4 RNA 连接酶缓冲液 重蒸水 KOH Tris-HCl T4 RNA 连接酶缓冲液 NEB 缓冲液 溶胶溶液
TOPO TA 克隆试剂盒
步骤
一、材料与设备
1. 寡核苷酸。
2. 乙腈。
3. 混合液 A：0.5 mmol AMP（5' 磷酸化）溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。
4. 混合液 B：1 mmol 三苯磷，1 mmol 2，2'- 双吡啶二硫化物，2.5 mmol 咪唑，0.90 ml 三乙胺，溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。
5. 沉淀液：9 mmol NaClO4，225 ml 丙酮，115 ml 乙醚 ( 无水乙醚)。
6. 25 mmol MgCl2。
7. 50 mmol/L ImpA ( ImpA 合成见操作方法第2部分）。
8. 0.2 mmol/L p17.91X ( 见操作方法第1部分，即 3' 末端封闭的 3' 端供体寡核苷酸）。
9. 上样液：8 mol/L 尿素，0.5 mmol/L EDTA。
10. 乙醇。
11. DEPC。
12. 糖原。
13. 5X T4 RNA 连接酶缓冲液：250 mmol/L Hepes ( pH 8.3 )，50 mmol/L MgCl2， 16.5 mmnol/L DTT，30 μg/ml BSA，41.5% 甘油。
14. T4 RNA 连接酶。
15. 反转录酶（invitrogen superscript RT）。
16. 重蒸水。
17. 10X dNTP( 1X dNTP 含有每种 dNTP 各 0.2 mmol/L）。
18. 100 mmol/L DTT。
19. 0.1 mol/L EDTA。
20. 1 mol/L KOH。
21. 1 mol/L Tris-HCl ( pH 1.0 )。
22. 0.2 mol/L MgCl2。
23. T4 DNA 连接酶。
24. 5X T4 RNA 连接酶缓冲液：250 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 )，50 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT，5 mmol/L ATP，125 μg/ml BSA。
25. BanⅠ限制性内切核酸酶。
26. 10X NEB 缓冲液 4：500 mmol/L 乙酸钾，200 mmol/L Tris-HAc，100 mmol/L 乙酸镁，10 mmoI/L DTT。
27. 溶胶溶液：20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1 mmol/L EDTA pH 8.0。
28. TOPO TA 克隆试剂盒。
29. Taq 酶。
30. M13F 引物：5' GGTAACGCCAGGGTTTTCC 3'。
31. M13R 引物：5' CAGGAAACAGCTATGACC 3'。
32. 1X 上样液：8 mol/L 尿素，0.5 mol/L EDTA。
二、操作方法
1. 寡核苷酸设计
(1) 用于 RNA 克隆的寡核苷酸（下划线部分为 BanⅠ酶切位点 G↓GYRCC）：
3' 端供体寡核苷酸：17, 91-pCTGTAGGCACCTCAAx（x：DMT-O-C3-CPG）。
5' 端受体寡核苷酸：17.93R ATCGTaggcacctgaaa（小写部分为 RNA，大写部分为 DNA）。
3' 端反转录引物：15.22-ATTGATGGTGCCTAC。
5' 端 PCR 引物：17.93D-ATCGTAGGCACCTGAAA。
3' 端 PCR 引物：17.92-ATTGATGGTGCCTACAG。
(2) 18 和 24 碱基 RNA Marker 转录序列：
T7 启动子可转录 24 个碱基的序列（斜体是 T7 启动子）。
44.12D：TCACTATTGTTGAGAACGTTGGCCTATAGTGAGTCGTATTACGC，从 44.12D 转录来的 RNA Marker（有 AclⅠ酶切位点）。
44.12R：GGCCAACGUUCUCAACAACAAUAGUGA。
从 Dharmacon 购买的 RNA Marker（含有 BamHⅠ酶切位点）。
18.113：AGCGUGUAGGGAUCCAAA。
2. ImpA 的合成
(1) 合成。合成 ImpA 的材料可从 Sigma 公司购买，要求纯度至少达到 99%，混合物 A 和混合物 B 用无水的烧杯盛装，将 A 缓慢地与 B 搅拌混合，开始时两种混合物不相溶，但当反应颜色转变为黄绿色的时候，固体物开始溶解，在烧杯底部出现的油状物最终也会溶解。室温搅拌 1~1.5 h。
(2) 纯化。一滴滴加入沉淀液，ImpA 开始析出，留 60 ml 液体供分析用。把沉淀转到离心管中，用丙酮洗余下的沉淀，5000 r/min 离心 10 min，倒出丙酮，用丙酮再洗 2 次。最后用乙醚洗，3000 g 离心 20 min，22.5~45℃ 之间真空干燥过夜，然后放在小瓶中 -20℃ 储存。
(3) 分析。称量合成物的重量。用 10 倍体积的饱和 (NH4)2SO4 预浸泡纤维素，然后干燥以进行纤维素薄层色谱分析。用水溶解 AMP 和 ImPA。分别将混合物 A、ImpA、混合物 B、纯化步骤中的留样液体、水溶解的 AMP 进行点样。用 80% 乙醇做展开液，展开 9 cm，AMP 最慢，ImpA 其次，混合物 B 和剩余物在最前端。用手提紫外灯观察。
3. 寡核苷酸的合成
所有的引物都用 Biosystems 公司的 8900 DNA 合成仪合成。
4. 放射性标记 RNA marker 的制备
体外转录 44.12D 获得 RNA Marker 44.12R。 用 32P 标记 RNA Marker 18.113 和 44.12R，再加 20％ 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，回收获得放射性标记的 18 和 24 碱基 RNA Marker（操作方法见相关章节）。
5. 寡核苷酸的腺苷酰化作用 1x 的合成
500 μl 反应体系中含 25 mmol MgCl2，50 mmol/L ImpA，0.2 mmol/L 17.91x。50℃ 孵育 3 h，20% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，胶厚度是 1.5 mm，上样孔为 23 mm 宽。电泳，切胶，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜，再用 2 倍体积的乙醇 -20℃ 沉淀至少一个小时，12000 g 离心 20 min，弃去上清，晾干沉淀，用蒸馏水溶解沉淀。得到的终产物 App 17.91x，可以在 -80°C 条件下保存数月。
6. 微 RNA 提纯
15% 变性聚丙烯酰胺胶，样孔宽 23 mm , 先进行预电泳处理，然后把提取的总 RNA 和痕量的高灵敏放射性标记的 RNA marker（放射性标记的 18.113 和 44.12R）以及 1 倍体积的上样液混合，80℃ 加热 5 min，上样，电泳，直至指示剂染料电泳到电泳槽底部，把胶取下，放射自显影，将放射标记物之间的部分从胶上切下，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜，再用 2 倍体积的乙醇沉淀，离心后重悬于 10~20 μl DEPC 处理过的水中。
7. 微 RNA 3' 端接头的连接
3' 端连接反应体系如下：5X RNA 连接缓冲液 2 μl，200 μmol/L App 17.91x 2 μl，T4 RNA 连接酶 1 μl，微 RNA、同位素标记的 RNA Marker 5 μl，总体积 10 μl。
室温反应 2~6 h 后用 10 μl 2X 上样液终止反应。用 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用放射性标记 Marker，从胶上把 35~43 个碱基之间的部分切下，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜，再用 2 倍体积的乙醇沉淀，最后溶解于 10~20 μl DEPC 处理过的水中。
8. 微 RNA 5' 端接头的连接
5' 端连接反应体系如下： 5X RNA 连接缓冲液 2 μl，200 μmol/L App 17.93R 2 μl，4 mmol/L ATP 1 μl，T4 RNA 连接酶 1 μl，微RNA 3' 端连接反应产物 5 μl，总体积 10 μl。
室温反应 2~6 h 后用 10 μl 2X 上样液终止反应。与 3' 端纯化用相同的方法，最终获得 52~60 个碱基的混合物，重悬于 10~20 μl DEPC 处理过的水中保存。
9. 连接产物微 RNA 的 RT-PCR
反应体系如下：RNA 连接产物 5 μl，100 μmol/L 15.22 3 μl，dH2O 5 μl，
混合后，30°C 加热 2 min，然后继续加入：
5X 反转录缓冲液 5 μl，10X dNTP 7 μl，100 mmol/L DTT 3 μl，Superscript Ⅱ 反转录酶 3 μl。
在加入反转录酶之前，先在 48 ℃ 预热 3 min，从总体积中取出 2 μl 做对照。所有试剂都加完后，在 48℃ 孵育 1 h，然后加入 1 μl 0.1 mol/L EDTA 和 3.8 μl 1 mol/L KOH，90℃ 加热 10 min，除去所有 RNA，然后用 4 μl 1 mol/L TriS-HCl pH 1.0 和 1 μl 0.2 mol/L MgCl2 中和反应。所有的RT反应产物都用于 PCR 扩增。
PCR 反应体系如下：反转录产物 5 μl，10X PCR 缓冲液 10 μl，10X dNTP 10 μl，100 μmol/L 17.92 1 μl，100 μmol/L 17.93D 1 μl，Taq 酶 2 μl，dH2O 71 μl，总体积 100 μl。
94°C 1 min，50°C 1 min，72℃ 1 min，扩增 20~25 个循环。
15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用 SYBR Gold ( 购于 Molecular Dynamics 公司） 染色。先用苯酚抽提 2 次，再用氯仿抽提 2 次，取水相，加入 NaCl 至 0.3 mol/L，用乙醇沉淀 PCR 扩增产物，最后溶解到 40 μl 中水。
10. PCR 产物的连接
用 BanⅠ消化 PCR 产物，反应用酶及其缓冲液购自于纽英伦生物技术有限公司。反应体系如下：PCR 产物 40 μl，NE 缓冲4 30 μl，BanⅠ20 U/μl 10 μl，dH2O 220 μl，总体积 300 μl。
37°C 反应 4 h。取 15 μl 用 15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，用 1 μl PCR 产物和 10 bp DNA ladder 做标准对照。用 SYBR Gold 染色。产物用酚和氯仿各抽提 2 次，加入 NaCl 至 0.3 mol/L，再用乙醇沉淀 BanⅠ消化的 PCR 产物。在沉淀中加入下列试剂，进行连接反应：H2O 8 μl，10X T4 DNA 连接酶缓冲液 1 μl，T4 DNA 连接酶 1 μl。
室温反应 30 min。琼脂糖电泳，用 100 bp DNA Marker 做标准。从胶上将大于 300 bp 的片段切下来，加 10 倍体积的溶胶液，65°C 放置 5 min，将融化的胶分到多个离心管中，加等体积的酚，振荡 20 s，冰浴 5 min，于 4℃ 5000 g 离心 10 min，移取水相，用苯酚：氯仿（1：1）混合物再抽提，最后用氯仿抽提。加 0.06 倍体积的 5 mol/L NaCl 和 2.5 倍体积的乙醇，-20℃ 沉淀 2 h 以上。
11. PCR 连接产物与 TOPO 载体的连接
将上步的沉淀溶解在以下的体系中：H2O 11.5 μl，10X PCR 缓冲液 1.5 μl，10X dNTP 1.5 μl，Taq 酶 0.5 μl。
72℃ 反应 5 min。取 5 μl 用于与 TOPO 载体连接。所有的连接产物都用于转化。在转化了的感受态菌中加 500 μl SOC 培养基，于 37℃ 培养 45 min，分別用 75 μl、150 μl、300 μl 涂氨芐抗性平板，37°C 生长过夜。
12. 筛选及测序
挑取白色克隆，划平板，生长过夜，用 PCR 筛选，PCR 反应体系如下：10X PCR 缓冲液 3 μl，10X dNTP 3 μl，100 μmol/L M13F 0.2 μl，100 μmol/L M13R 0.2 μl，Taq 酶 0.5 μl，dH2O 23 μl，总体积 30 μl。
94°C 3 min，94°C 40 s，50°C 40 s，72°C 40 s，进行 25 个循环。琼脂糖凝胶电泳检测，选择包含约为 500~800 bp 插入序列的克隆进行测序。采用生物信息学方法对序列进行分析。
1. 寡核苷酸。
2. 乙腈。
3. 混合液 A：0.5 mmol AMP（5' 磷酸化）溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。
4. 混合液 B：1 mmol 三苯磷，1 mmol 2，2'- 双吡啶二硫化物，2.5 mmol 咪唑，0.90 ml 三乙胺，溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。
5. 沉淀液：9 mmol NaClO4，225 ml 丙酮，115 ml 乙醚 ( 无水乙醚)。
6. 25 mmol MgCl2。
7. 50 mmol/L ImpA ( ImpA 合成见操作方法第2部分）。
8. 0.2 mmol/L p17.91X ( 见操作方法第1部分，即 3' 末端封闭的 3' 端供体寡核苷酸）。
9. 上样液：8 mol/L 尿素，0.5 mmol/L EDTA。
10. 乙醇。
11. DEPC。
12. 糖原。
13. 5X T4 RNA 连接酶缓冲液：250 mmol/L Hepes ( pH 8.3 )，50 mmol/L MgCl2， 16.5 mmnol/L DTT，30 μg/ml BSA，41.5% 甘油。
14. T4 RNA 连接酶。
15. 反转录酶（invitrogen superscript RT）。
16. 重蒸水。
17. 10X dNTP( 1X dNTP 含有每种 dNTP 各 0.2 mmol/L）。
18. 100 mmol/L DTT。
19. 0.1 mol/L EDTA。
20. 1 mol/L KOH。
21. 1 mol/L Tris-HCl ( pH 1.0 )。
22. 0.2 mol/L MgCl2。
23. T4 DNA 连接酶。
24. 5X T4 RNA 连接酶缓冲液：250 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 )，50 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT，5 mmol/L ATP，125 μg/ml BSA。
25. BanⅠ限制性内切核酸酶。
26. 10X NEB 缓冲液 4：500 mmol/L 乙酸钾，200 mmol/L Tris-HAc，100 mmol/L 乙酸镁，10 mmoI/L DTT。
27. 溶胶溶液：20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1 mmol/L EDTA pH 8.0。
28. TOPO TA 克隆试剂盒。
29. Taq 酶。
30. M13F 引物：5' GGTAACGCCAGGGTTTTCC 3'。
31. M13R 引物：5' CAGGAAACAGCTATGACC 3'。
32. 1X 上样液：8 mol/L 尿素，0.5 mol/L EDTA。
二、操作方法
1. 寡核苷酸设计
(1) 用于 RNA 克隆的寡核苷酸（下划线部分为 BanⅠ酶切位点 G↓GYRCC）：
3' 端供体寡核苷酸：17, 91-pCTGTAGGCACCTCAAx（x：DMT-O-C3-CPG）。
5' 端受体寡核苷酸：17.93R ATCGTaggcacctgaaa（小写部分为 RNA，大写部分为 DNA）。
3' 端反转录引物：15.22-ATTGATGGTGCCTAC。
5' 端 PCR 引物：17.93D-ATCGTAGGCACCTGAAA。
3' 端 PCR 引物：17.92-ATTGATGGTGCCTACAG。
(2) 18 和 24 碱基 RNA Marker 转录序列：
T7 启动子可转录 24 个碱基的序列（斜体是 T7 启动子）。
44.12D：TCACTATTGTTGAGAACGTTGGCCTATAGTGAGTCGTATTACGC，从 44.12D 转录来的 RNA Marker（有 AclⅠ酶切位点）。
44.12R：GGCCAACGUUCUCAACAACAAUAGUGA。
从 Dharmacon 购买的 RNA Marker（含有 BamHⅠ酶切位点）。
18.113：AGCGUGUAGGGAUCCAAA。
2. ImpA 的合成
(1) 合成。合成 ImpA 的材料可从 Sigma 公司购买，要求纯度至少达到 99%，混合物 A 和混合物 B 用无水的烧杯盛装，将 A 缓慢地与 B 搅拌混合，开始时两种混合物不相溶，但当反应颜色转变为黄绿色的时候，固体物开始溶解，在烧杯底部出现的油状物最终也会溶解。室温搅拌 1~1.5 h。
(2) 纯化。一滴滴加入沉淀液，ImpA 开始析出，留 60 ml 液体供分析用。把沉淀转到离心管中，用丙酮洗余下的沉淀，5000 r/min 离心 10 min，倒出丙酮，用丙酮再洗 2 次。最后用乙醚洗，3000 g 离心 20 min，22.5~45℃ 之间真空干燥过夜，然后放在小瓶中 -20℃ 储存。
(3) 分析。称量合成物的重量。用 10 倍体积的饱和 (NH4)2SO4 预浸泡纤维素，然后干燥以进行纤维素薄层色谱分析。用水溶解 AMP 和 ImPA。分别将混合物 A、ImpA、混合物 B、纯化步骤中的留样液体、水溶解的 AMP 进行点样。用 80% 乙醇做展开液，展开 9 cm，AMP 最慢，ImpA 其次，混合物 B 和剩余物在最前端。用手提紫外灯观察。
3. 寡核苷酸的合成
所有的引物都用 Biosystems 公司的 8900 DNA 合成仪合成。
4. 放射性标记 RNA marker 的制备
体外转录 44.12D 获得 RNA Marker 44.12R。 用 32P 标记 RNA Marker 18.113 和 44.12R，再加 20％ 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，回收获得放射性标记的 18 和 24 碱基 RNA Marker（操作方法见相关章节）。
5. 寡核苷酸的腺苷酰化作用 1x 的合成
500 μl 反应体系中含 25 mmol MgCl2，50 mmol/L ImpA，0.2 mmol/L 17.91x。50℃ 孵育 3 h，20% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，胶厚度是 1.5 mm，上样孔为 23 mm 宽。电泳，切胶，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜，再用 2 倍体积的乙醇 -20℃ 沉淀至少一个小时，12000 g 离心 20 min，弃去上清，晾干沉淀，用蒸馏水溶解沉淀。得到的终产物 App 17.91x，可以在 -80°C 条件下保存数月。
6. 微 RNA 提纯
15% 变性聚丙烯酰胺胶，样孔宽 23 mm , 先进行预电泳处理，然后把提取的总 RNA 和痕量的高灵敏放射性标记的 RNA marker（放射性标记的 18.113 和 44.12R）以及 1 倍体积的上样液混合，80℃ 加热 5 min，上样，电泳，直至指示剂染料电泳到电泳槽底部，把胶取下，放射自显影，将放射标记物之间的部分从胶上切下，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜，再用 2 倍体积的乙醇沉淀，离心后重悬于 10~20 μl DEPC 处理过的水中。
7. 微 RNA 3' 端接头的连接
3' 端连接反应体系如下：5X RNA 连接缓冲液 2 μl，200 μmol/L App 17.91x 2 μl，T4 RNA 连接酶 1 μl，微 RNA、同位素标记的 RNA Marker 5 μl，总体积 10 μl。
室温反应 2~6 h 后用 10 μl 2X 上样液终止反应。用 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用放射性标记 Marker，从胶上把 35~43 个碱基之间的部分切下，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜，再用 2 倍体积的乙醇沉淀，最后溶解于 10~20 μl DEPC 处理过的水中。
8. 微 RNA 5' 端接头的连接
5' 端连接反应体系如下： 5X RNA 连接缓冲液 2 μl，200 μmol/L App 17.93R 2 μl，4 mmol/L ATP 1 μl，T4 RNA 连接酶 1 μl，微RNA 3' 端连接反应产物 5 μl，总体积 10 μl。
室温反应 2~6 h 后用 10 μl 2X 上样液终止反应。与 3' 端纯化用相同的方法，最终获得 52~60 个碱基的混合物，重悬于 10~20 μl DEPC 处理过的水中保存。
9. 连接产物微 RNA 的 RT-PCR
反应体系如下：RNA 连接产物 5 μl，100 μmol/L 15.22 3 μl，dH2O 5 μl，
混合后，30°C 加热 2 min，然后继续加入：
5X 反转录缓冲液 5 μl，10X dNTP 7 μl，100 mmol/L DTT 3 μl，Superscript Ⅱ 反转录酶 3 μl。
在加入反转录酶之前，先在 48 ℃ 预热 3 min，从总体积中取出 2 μl 做对照。所有试剂都加完后，在 48℃ 孵育 1 h，然后加入 1 μl 0.1 mol/L EDTA 和 3.8 μl 1 mol/L KOH，90℃ 加热 10 min，除去所有 RNA，然后用 4 μl 1 mol/L TriS-HCl pH 1.0 和 1 μl 0.2 mol/L MgCl2 中和反应。所有的RT反应产物都用于 PCR 扩增。
PCR 反应体系如下：反转录产物 5 μl，10X PCR 缓冲液 10 μl，10X dNTP 10 μl，100 μmol/L 17.92 1 μl，100 μmol/L 17.93D 1 μl，Taq 酶 2 μl，dH2O 71 μl，总体积 100 μl。
94°C 1 min，50°C 1 min，72℃ 1 min，扩增 20~25 个循环。
15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用 SYBR Gold ( 购于 Molecular Dynamics 公司） 染色。先用苯酚抽提 2 次，再用氯仿抽提 2 次，取水相，加入 NaCl 至 0.3 mol/L，用乙醇沉淀 PCR 扩增产物，最后溶解到 40 μl 中水。
10. PCR 产物的连接
用 BanⅠ消化 PCR 产物，反应用酶及其缓冲液购自于纽英伦生物技术有限公司。反应体系如下：PCR 产物 40 μl，NE 缓冲4 30 μl，BanⅠ20 U/μl 10 μl，dH2O 220 μl，总体积 300 μl。
37°C 反应 4 h。取 15 μl 用 15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，用 1 μl PCR 产物和 10 bp DNA ladder 做标准对照。用 SYBR Gold 染色。产物用酚和氯仿各抽提 2 次，加入 NaCl 至 0.3 mol/L，再用乙醇沉淀 BanⅠ消化的 PCR 产物。在沉淀中加入下列试剂，进行连接反应：H2O 8 μl，10X T4 DNA 连接酶缓冲液 1 μl，T4 DNA 连接酶 1 μl。
室温反应 30 min。琼脂糖电泳，用 100 bp DNA Marker 做标准。从胶上将大于 300 bp 的片段切下来，加 10 倍体积的溶胶液，65°C 放置 5 min，将融化的胶分到多个离心管中，加等体积的酚，振荡 20 s，冰浴 5 min，于 4℃ 5000 g 离心 10 min，移取水相，用苯酚：氯仿（1：1）混合物再抽提，最后用氯仿抽提。加 0.06 倍体积的 5 mol/L NaCl 和 2.5 倍体积的乙醇，-20℃ 沉淀 2 h 以上。
11. PCR 连接产物与 TOPO 载体的连接
将上步的沉淀溶解在以下的体系中：H2O 11.5 μl，10X PCR 缓冲液 1.5 μl，10X dNTP 1.5 μl，Taq 酶 0.5 μl。
72℃ 反应 5 min。取 5 μl 用于与 TOPO 载体连接。所有的连接产物都用于转化。在转化了的感受态菌中加 500 μl SOC 培养基，于 37℃ 培养 45 min，分別用 75 μl、150 μl、300 μl 涂氨芐抗性平板，37°C 生长过夜。
12. 筛选及测序
挑取白色克隆，划平板，生长过夜，用 PCR 筛选，PCR 反应体系如下：10X PCR 缓冲液 3 μl，10X dNTP 3 μl，100 μmol/L M13F 0.2 μl，100 μmol/L M13R 0.2 μl，Taq 酶 0.5 μl，dH2O 23 μl，总体积 30 μl。
94°C 3 min，94°C 40 s，50°C 40 s，72°C 40 s，进行 25 个循环。琼脂糖凝胶电泳检测，选择包含约为 500~800 bp 插入序列的克隆进行测序。采用生物信息学方法对序列进行分析。
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