用RNase III制备siRNA库来诱发RNAi

小分子干扰RNA (Small interfering RNA ，siRNA ) 是一种非常有效的工具，能够在包括哺乳动物细胞在内的多个体系中抑制特定基因的表达，从而研究某个基因的功能或者是相关信息。但是这种强有力的方法的难题之一是需要设计，合成siRNA s 和验证其效果，从而找到最有效的siRNA s 。

这个过程需要花费相当的时间和经费。以化学法合成基因特异的siRNA s 为例，由于设计好的siRNA s 中通常只有大约25% 的siRNA s 能高效抑制基因的表达（抑制效率>80% ），这使得化学合成siRNA 的成本升高。

体外转录制备长片断RNA 并不难，但是由于研究表明长片断的双链RNA （>29bps ）在哺乳动物细胞中通常会引发抗病毒反应―― 一种非特异基因表达抑制，而目前体外转录往往无法制备小于29bp 的小分子siRNA s 。

一个新的研究发现，用RNase III 降解长片断双链RNA 成为siRNA s 库也能够有效诱导特异的基因沉默，这样可以避免了筛选有效siRNA s 的漫长过程，从而快速，经济的实现特定基因表达的沉默。

在线虫、果蝇和其他一些物种的RNA 干扰(RNA interference ，RNA i) 通路中，长片断的双链RNA 进入细胞后会被一个类似RNase III 的内切核糖核酸酶(Dicer) 降解为一系列的21―23bp 长度，3’端有两个碱基突出（带羟基）5’磷酸化的siRNA s 。这些siRNA s 介导同源转录本的降解，从而导致基因表达沉默。( 1-5)

大肠杆菌Escherichia coli RNase III 参与多种细菌RNA s，噬菌体甚至是质粒来源的RNA s 降解(6-9) ，能够将长片断的双链RNA s降解为一系列12―15bp 的短双链RNA s，产物末端结构类似Dicer 降解产物(9) ，通过改变RNA seIII 的酶切条件可以提高降解产物的平均长度，达到目前的21bp。

这些21bp的降解产物能够有效介导在哺乳动物细胞和小鼠胚胎中特定基因的RNA i(10,11) 。另外，实验表明，RNase III 的完全降解产物（12―15bp）同样可以诱导专一的基因沉默，效果与化学合成或者是酶法得到的siRNA s 相当。

验证RNaseIII 的消化能力

采用RNaseIII 分别消化体外转录制备的人源GAPDH ，La 和c-FOS(200 bp) 双链RNA ，从而验证RNaseIII 的消化能力，结果表明，1个单位的RnaseIII 在37度1小时可以将1mg 的双链RNA 降解为30bp以下，主要是12―15bp 的siRNA s 混合物。

用其他基因的双链RNA ，同样证实RNaseIII 能够消化各种双链RNA 序列。另外用Cyclophillin, c-myc, Map Kinase 9, PKC-alpha, Raf-1, Nautilus, 和 h-ras 等基因的双链RNA 作为 RNase III 底物，也可以得到同样的结果。这表明 RNase III 能够消化各种来源的双链RNA 。

验证 RNaseIII 降解产物诱导基因沉默的能力

GAPDH 和La 在Hela细胞中的丰度高，也比较容易检测内源基因的表达水平。将RNaseIII降解GAPDH 和La 得到的siRNA s 库转入Hela 细胞，用免疫荧光法检测其诱导基因沉默的能力。根据所检测的细胞数量对荧光信号进行平衡化和定量。

但是内源的c-FOS 在293细胞中的丰度较低，表达水平下调后就难以检测，为了做同样的验证，实验采用50nM 佛波脂 phorbol ester (PMA) 提前24小时诱导处理使c-FOS 表达水平升高。

用由RNase III 消化c-FOS 双链RNA 得到的siRNA s 混合物转染293细胞，用同样方法检测对基因表达的抑制效果。结果显示用RNase III 消化各种双链RNA 得到的siRNA 库对相应的基因表达抑制效果分别是：GAPDH 表达水平下调78% ，La 表达水平下调86% ，而c-FOS 表达水平则下调75% 。

这个结果表明RNase III 得到的siRNA s 库能够非常有效的抑制基因的表达。

Figure 1. Silencing Gene Targets by RNase III Derived siRNA Cocktails. A 200 bp dsRNA (15 µg) for each gene of interest was digested with 2.5 U RNase III for 1 hour at 37℃. 1A. RNase III efficiently digests dsRNA . One microgram of the dsRNA before and after RNase III digestion was run on a 15% non-denaturing acrylamide gel along with a 21 bp chemically synthesized siRNA to GAPDH, which served as a size marker. The gel was stained with ethidium bromide and photographed under UV light. 1B. RNase III derived siRNA cocktails silence GAPDH, La and c-FOS. GAPDH and La siRNA cocktails were transfected into HeLa cells. The c-fos siRNA mixture was transfected into 293 cells followed by 24 hours of stimulation with 50 nM PMA. All samples were harvested at 48 hours post transfection and immunofluorescence was performed with the appropriate antibodies. Fluorescence signal was quantitated, normalized for cell number and graphed.