单链DNA文库的SELEX筛选

SELEX 技术除了可以使用 RNA 文库以外，还可以使用单链 DNA 文库进行筛选。单链 DNA 形成高级结构的丰富性也足够用于对许多靶分子的筛选，而且 DNA 文库具有更好的稳定性，操作也相对简便。

3' 引物 链亲和素磁珠
电泳仪 PCR 仪 离心机 凝胶成像仪 液体闪烁仪 长波紫外灯 紫外分光光度计 核酸定暈仪 pH计 培养箱 振荡器 洁净工作台

一、材料与设备

1. 5' '端标记有生物素的 3' 引物。

2. 链亲和素磁珠（Promega 公司）。

其他设备与试剂与 RNA 文库方案一致。

二、操作方法

1. 不对称 PCR 制备 ssDNA

(1) 首先将筛选获得的 ssDNA 参照 RNA 文库的实验方案扩增成双链 DNA，纯化回收。

(2) 确定不对称 PCR 制备 ssDNA 文库所需的最佳双链 DNA 模板量。取不同量的上述 PCR 产物为模板，不对称 PCR 扩增 35 个循环。

不对称 PCR 反应体系如下：10X PCR 反应缓冲液 10 μl，dNTP 混合液 8 μl，5' 引物（25 pmol/μl )  2 μl，3' 引物（1 pmol/μl )  0.5 μl，dsDNA 模板 不定，Taq DNA 聚合酶（2 U/μl ) 1 μl，加去离子水补齐至 100 μl。

PCR 反应条件：95℃ 预变性 5 min；94℃ 变性 30 s，55℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30s，扩增 35 个循环；最后 72°C 终延伸 5 min。

含 7 mol/L 尿素的 12% 变性 PAGE 观察，单链 DNA 条带应比双链 DNA 的条带略为偏上，挑选出能产生大量且条带清晰的单链 DNA 的双链 DNA 模板最作为最佳量。

(3) 取最佳双链 DNA 模板量进行大量不对称 PCR 扩增，含 7mol/L 尿素的 12% 变性 PAGE 切胶纯化，然后用核酸定量仪确定 ssDNA 的量用于下一轮筛选。

(4) 在第一轮筛选中，投入的 ssDNA 是直接合成的。

2. 链亲和素磁珠制备 ssDNA

(1) 用 5' 端标记有生物素的 3' 引物将筛选获得的 ssDNA 扩增成双链 DNA，纯化回收，用 SHMCK 缓冲液溶解至 20 μl。

(2) 链亲和素磁珠的准备。取 0.5 ml 链亲和素磁珠用 0.5X SSC 洗三遍，每次 600 μl，每次 1 min，再用 SHMCK 缓冲液洗三遍，每次 600 μl，每次 1 min。

(3) 将双链 DNA 与磁珠混合，再加入 40 μl SHMCK 缓冲液，室温孵育 30 min（在 DNA 混合器上使之充分混合）。

(4) 磁铁吸附后弃上清，用 SHMCK 缓冲液洗三遍，每次 600 μl，每次 1 min。

(5) 加入 0.15 mol/L NaOH 400 μl，将双链 DNA 裂解为 ssDNA，于 37℃ 孵育 15 min。

(6) 磁铁吸附后吸出上清，并加入 20 μl 3mol/L HCl 中和其中的 NaOH，调整其中的缓冲体系为1X SHMCK，0.1% 明胶，12 μg/μL tRNA，总体积为 500 μl，进入下一轮筛选。

防止RNA酶的污染。