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RNA实验

从革兰氏阳性菌中分离RNA

2024-06-20 RNA实验 加入收藏
材料与仪器10 ml 细菌培养物DEPC 处理的水 裂解缓冲液 酚 氯仿 异戊醇 5mol LNaCl 冰冷的无水乙醇 70% 乙醇 DNA 酶消化缓冲液 TE


材料与仪器

10 ml 细菌培养物
DEPC 处理的水 裂解缓冲液 酚 氯仿 异戊醇 5mol LNaCl 冰冷的无水乙醇 70% 乙醇 DNA 酶消化缓冲液 TE 缓冲液
离心机 带微探头的超声仪

步骤

一 材料与设备

1)10 ml 细菌培养物,

2)DEPC 处理的水。

3) 裂解缓冲液:30 mmol/LTris-Cl(PH7.4),100 mmol/LNaCl,5 mmol/LEDTA,1%(M/V)SDS, 使用前加蛋白酶 K 至 100ug/ml

4) 酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1), 酚用 Tris-Cl(pH8.0) 平衡

5)24:1 氯仿:异戊醇

6)5mol/LNaCl。

7) 冰冷的无水乙醇和 70% 乙醇。

8)DNA 酶消化缓冲液:20 mmol/LTris-Cl(pH8.0),10 mmol/LMgCI2,2.5 mg/ml无 RNA 酶的 DNA 酶

9)TE 缓冲液 (PH8.0)。

10) 离心机。

11) 带微探头的超声仪,

二 操作方法

1) 于 4℃12000 g 离心,从 10 ml 细阐培养物中回收细胞,重悬菌体于 0.5 ml 裂解缓冲液,并移入微量离心管中,在干冰屮冻结

2) 解冻并用微探头超声仪以 30W 超声 3 次,每次 l0S,避免起泡,37℃ 温育 6Omin。

3) 加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 抽提,于室温用微量离心机高速离心 3 min,上层水相移入另一干净微量离心管中。

4) 用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 再抽提 1 次,再用氯仿:异戊醇(24:1) 抽提 1次。

5)400ul 水相加入 15ul 5mol/LNaCl,并加满冰冷的无水乙醇,混匀并于冰上放置 15〜30 min 或于-20℃ 过夜

6)于 4℃ 用微量离心机离心 15 min 沉淀用冰冷的 70% 乙醇冲洗,晾干,用 95ul DMA 酶消化缓冲液溶解沉淀,加 4ul 2.5 mg/ml 无 RNA 酶的 DNA 酶 I,37℃ 温育60 min

7) 用酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 抽提 1 次,移出水相,有机相加入 100ulTE 冲液,混匀,于室温下用微暈离心机高速离心5min,合并两次的水相。

8) 用氯仿:异戊醇(24:1) 抽提 1 次,加入 10ul 5mol/L NaCl 和 60ul 无水乙醇,在20°C 过夜或置于干冰/乙醇中 15 min 用微量离心机于 4℃ 下高速离心 15〜30 min

9) 用 500ul70% 乙醇洗涤沉淀,晾干。溶解于 100ulDEPC 处理过的水。取 10UL 稀释于 lml 水. 测 A260 和 A280 以定量 RNA, 保存于-70℃ 或以乙醇沉淀的形式保存。


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