Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > RNA实验

RNA实验

光活化的核苷酸类似物介导的RNA-蛋白的交联实验

RNA
2024-06-20 RNA实验 加入收藏
原理光化学交联技术是研究核搪核蛋内复合物中 RNA 与蛋白的相互作用的有效手段。 其基本原理是未经任何化学修饰的 RNA -蛋白天然复合物在短波长紫外线(254


原理

光化学交联技术是研究核搪核蛋内复合物中 RNA 与蛋白的相互作用的有效手段。 其基本原理是未经任何化学修饰的 RNA -蛋白天然复合物在短波长紫外线(254 nm ) 照射时,RNA 中的核苷酸和蛋白质中的氨基酸会产生光化学反应,转变为活性状态,进而形成分子间共价交联。

材料与仪器

FPLC纯化的核苷酸 Sephadex G-50
缓冲液A 甘油 乙酰化牛血清白蛋白 缓冲液B 缓冲液C 肝素 缓冲液F 酚 氯仿 异戊醇 无RNase的DNaseI 叠氮苯酰溴 缓冲液D 缓冲液C TBE缓冲液 蛋白上样缓冲液 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶 转移缓冲液 银染试剂
紫外光源号 离心管 X 射线片 增感屏 硝酸纤维素膜 电转移装

步骤

―、材料与设备

1. 全长含核苷酸类似物的 RNA 合成

所有的缓冲液配制均需采用经过蒸馏并灭菌的去离子水

(1) 缓冲液 A:20 mmol/L Tris-HAc ( pH 8.0 ),10 mmol/L Mg(Ac)2,50 mmol/L 谷氨酸钾。

(2) 5% (V/V) 甘油,40 mmoI/L Na2EDTA ( pH 8.0 ),40 μg/mL 乙酰化牛血清白蛋白,-20℃ 保存。

(3) 缓冲液 B:1.5 mol/L NH4Ac,37.5 mmol/L Na2EDTA( pH 8.0 ),50 μg/ml 无RNase 的 tRNA,20℃ 保存。

(4) 缓冲液 C (2X):8 mol/L 尿素,0.1% (m/V) 二甲苯青,0.1% (m/V) 溴酚蓝。

(5) FPLC 纯化的核苷酸,ATP,CTP,GTP,UTP,-80°C 保存。

(6) 5-SH-UTP,5-SH-CTP,5-APAS-UTP 和 5-APAS-CTP 配制成 1~3 mol/L 的水溶液,-80℃ 避光保存。

(7) T7 噬菌体 RNA 聚合酶或大肠杆菌 RNA 聚合酶。

(8) [ α-32P ] GTP 的工作浓度范围为 105 cpm/pmol~10cpm/pmol。

(9) 1 mol/L NH4Ac 以无水乙醇配制,室温保存。

(10) 肝素:0.5 mg/ml 水溶液,-20°C 保存。

(11) 缓冲液 F:40 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6),15 mmol/L MgCl2,10 mmol/L β-巯基乙醇,乙酰化牛血淸白蛋白。

(12) 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1 )。

(13) 80% (V/V) 乙醇。

(14) RQ1 无 RNase 的 DNase I ( Promega 公司)。

(15) 紫外光源号:Spectroline model XX-15B,Spectroline 公司)。

(16) 1 ml 离心管。

2. 分子表面掺入具光交联活性的核苷酸类似物的 RNA 合成

(1) 100 mmol/L 叠氮苯酰溴(Azidophenacyl bromide,APB,Sigma 公司)溶于硫酸二甲酯。

(2) Sephadex G-50,DNA 级。

(3) 缓冲液 D:30 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.0 ),10 mmol/L KCl,0.5 mmol/L Na2EDTA ( pH 8.0 )。

3. RNA 与蛋白的交联

(1) 缓冲液 C(2X):8 mol/L 尿素,0.1%(m/V)二甲苯青,0.1%(m/V)溴酚蓝。

(2) 10X TBE 缓冲液:0.89 moI/L Tris 碱,0.89 mol/L 硼酸,20 mmol/L EDTA,室温保存。

(3) X 射线片。

(4) 增感屏。

(5) RNase T1 消化缓冲液:25 mmol/L 柠檬酸钠,1 mmol/L Na2EDTA ( pH 8.0 ),-20°C 保存。

(6) RNase T1。

(7) 2X 蛋白上样缓冲液:60 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0 ),60 mmol/L DTT,3.4% (m/V) SDS,17% (V/V) 甘油, 0.02% (m/V) 溴酚蓝;DTT 临用前加。

(8) SDS 变性聚丙烯酰胺凝胶。

(9) 转移缓冲液:25 mmol/L Tris,192 mmol/L 甘氨酸,20% (V/V) 甲醇,4℃ 保存。

(10) 硝酸纤维素膜。

(11)电转移装。

(12) 银染试剂:2% (m/V) 柠檬酸钠,0.8% (m/V) 硫酸亚铁,0.1% (m/V) 硝酸银,4℃ 保存。

二、操作方法

1. 全长含核苷酸类似物的 RNA 合成

(1) 100 μl 反应体系中加入终浓度为 100 nmoI/L 模板 DNA,100 nmol/L 大肠杆菌 RNA 聚合酶及缓冲液 A (或 T7 噬菌体聚合酶及缓冲液 F),于 37℃ 孵育 5 min。

(2) 避光加入 100 μmol/L ATP,10 μmol/L UTP 或 CTP,20 μmol/L [ α-32P] GTP,150 μmol/L 5-APAS-UTP 或 5-APAS-CTP,以及加入浓度逐渐递增的 UTP 或 CTP ( 0 μmol/L,1 μmol/L,5 μmol/L,10 μmol/L,20 μmol/L 孵育 5 min。

(3) 加 1 μl 肝素,于 37℃ 孵育 10 min。

(4) 加入RQ1 无 RNase 的 DNase I (5U) ,于 37℃ 孵育 10 min。

(5) 加入 100 mmol/L MgCl2,20 μg 无 RNase 的 tRNA。

(6) 加入等体积 (100 μl ) 酚:氯仿:异戊醇(25 : 24 : 1) ,振荡混匀,14000 g 离心 5 min。

(7) 取上层水相至一新离心管,加入 3 倍体积(300 μl ) 的含 1 mol/L NH4Ac 的乙醇,混匀,冰浴 10 min,14000 g 离心 5 min。

(8) 小心去除上清,以 100 μl 80% (V/V) 乙醇洗 RNA,14000 g 离心 5 min。

(9) 小心去除上清,晾干。

(10) 将 RNA 溶于 100 μl 去离子水或缓冲液中。

(11) 将反应产物等分,取一半加入一干净离心管,将管置于 UV ( 302 nm max) 光源 1.5 cm 处,室温照射 2 mm,另一半反应产物在照射过程中置于室温避光处。

(12) 加 100 mmol/L DTT 以还原残余叠氮化合物,避光反应至少 5 min(以后操作不必再避光)。

(13) 加入等体积 2X 缓冲液 C;于 95°C 孵育 2 min;冰浴冷却;7 mol/L 尿素/聚內烯 酰胺胶电泳(胶浓度及长度取决于待检测 RNA 的大小,RNA 大小与胶浓度有以下对应关系:大于 100 nt,6%;30~100 nt,5%;小于 30 nt,25%)。

(14) 在压片盒内依次铺上滤纸,胶,保鲜膜,X线片,增感屏;-80℃ 放射自显影过夜。

(15) 从放射自显影结果分析最适 UTP 或 CTP 浓度。

(16) 按方法“RNA 与蛋白交联”进行 RNA 蛋白质交联。

2. 分子表面掺入具光交联活性的核苷酸类似物的 RNA 合成

(1) 按方法“全长含核苷酸类似物的 RNA 合成”中的步骤(1)~(10)制备并纯化插入 5-SH-UTP 或 5-SH-CTP 的 RNA,调 pH 7.0。

(2) 避光环境加入 APB(溶解于二甲基砜),终浓度 5 mmol/L。

(3) 室温避光孵育 2 h。

(4) 制备 Sephadex G-50 柱:称取 7 g Scphadex G-50,加 100 ml 去离子水,悬浮液高压灭菌。将 1 ml 的 Sephadex G-50 悬浮液加入 1 ml 的柱内,3500 g 离心 3 min,重复上样至柱内凝胶体积达 750 μl。

(5) 以 200 μl 缓冲液 D 平衡柱,3500 g 离心 4 min,重复 3 次,弃洗脱液。

(6) 避光加入 200 μl 反应液 [ 凝胶与样本液之间的比例 ( 750:200 ) 十分关键 ]。

(7) 3000 g 离心 3 min。

(8) 收集流出液,按方法“RNA 与蛋白交联” 进行 RNA-蛋白质交联。

3. RNA 与蛋白交联

(1) 在 RNA-蛋白质交联中采用前面实验优化得到的最佳 UTP 和 CTP 浓度,重复方法1 中的步骤 (1)~(9),用灭菌的去离子水或适宜的缓冲液 (根据相应的 RNA 或蛋白决定)重悬 RNA,加入适宜浓度的可能与 RNA 结合的蛋白。

(2) 将反应产物等分,取一半加入一干净离心管,将管置于 UV 光源 1.5 cm 处,室温 (有些结合需要特定的反应温度)照射 2 min,另一半反应产物在照射过程中置于室温避光处作为阴性对照。

(3) 加入 DTT 至终浓度 100 mmol/L,避光放置至少 5 min(此后步骤不必再避光)。

(4) 从未受照射的样本中取出少量样品用于鉴定所用 RNA 长度的正确性。[ 见方法“全长含核苷酸类似物的 RNA 合成”中,步骤 (13) ]。

(5) 余下样品加入等体积的 RNase T1 消化缓冲液及 10 U/μl RNase T1,于 37°C 孵育 10 min。

(6) 加入等体积的 2X 蛋白上样缓冲液,94°C 加热 2~3 min,变性 SDS-PAGE 电泳。

(7) 常规“三文治”法电转移:500 mA,2 h。

(8) 取膜银染至见到条带(约 5 min),空气下燥。

(9) X 射线片,-80°C 放射自显影至交联蛋白显现 ( 对交联效率低的蛋白可能需要数天)。



文章底部广告位

文章评论

加载中~