5.7 RNA 原位杂交
原理原位杂交的原理是含有互补序列（探针）的被标记的单链 DNA 或 RNA 片段在适当 的条件下与细胞的 DNA 或 RNA 杂交形成稳定的杂交体。无论是 DN
原理
原位杂交的原理是含有互补序列（探针）的被标记的单链 DNA 或 RNA 片段在适当 的条件下与细胞的 DNA 或 RNA 杂交形成稳定的杂交体。无论是 DNA( dsDNA、寡核苷酸和 ssDNA ) 或是 RNA( SSC RNA) 探针均能用于定位 DNA 和 mRNA，并且均能用于两 个主要类型的标记策略：直接标记，即用报道分子（如同位素）附着于 DNA 或 RNA；间接标记，在该法中将半抗原（如生物素或地高辛）附着于探针上，然后用标记的结合蛋白 (如亲合素）检测或者用特异性的抗体检测靶探针杂交体。这些基本步骤是相互依赖的，为了得到最佳结果，前面步骤中的任何一个变化均要求以后的步骤作出相应的变化。事实上 对于许多组织化学的步骤来说，一个给定系统的“理想方法”肯定是靠大量实践检验建立起来的。
材料与仪器
线状 DNA 模板 DNaseⅠ 抗荧光素-碱性磷酸醋酶结合物
转录缓冲液 人胎盘核糖核酸酶抑制剂 DTT 核苷酸溶液 冰乙酸 NaHCO3 乙酸钠 酵母 tRNA 杂交缓冲液 SSC储存液 封闭缓冲液 检测缓冲液 NBT溶液 BCIP溶液
转录缓冲液 人胎盘核糖核酸酶抑制剂 DTT 核苷酸溶液 冰乙酸 NaHCO3 乙酸钠 酵母 tRNA 杂交缓冲液 SSC储存液 封闭缓冲液 检测缓冲液 NBT溶液 BCIP溶液
步骤
一、材料与设备
1. 转录缓冲液：200 mmol/I Tris-HCl ( pH 7.5 )，30 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 亚精胺，0.5%（m/V）BSA。
2. 人胎盘核糖核酸酶抑制剂（human placental ribonuclease inhibitor, HPRT) : 20 U/μl。
3. 2 mmol/L DTT : 新鲜配制，过滤除菌。
4. 线状 DNA 模板：通常 0.5~1 μg/μl。
5. SP6，T7 或 T3RNA 聚合酶。
6. 核苷酸溶液：1.25 mmol/L ATP、1.25 mmol/L GTP、1.25 mmol/L CTP、0.312 mmol/L UTP、0. 312 mmol/L 荧光素-11-UTP 溶于灭菌水。
7. 无 RNase 的 DNaseⅠ：用灭菌水新鲜配制，稀释至 10 U/ 80 μl。
8. 4 mol/L NaHCO3，高压灭菌。
9. 6 mol/L NaHCO3，高压灭菌。
10. 冰乙酸。
11. 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2）高压灭菌。
12. 10 mg/ml 酵母 tRNA。
13. 杂交缓冲液：可用标准杂交缓冲液。这里推荐一种优化缓冲液成品，可从 Amersham 公句购得。缓冲液由以下成分组成： 4XSSC，600 μg/ml 鲑鱼精 DNA，2X Denhardt 溶液。此杂交缓冲液还含有一种用于提高杂交效率的专利化合物。在使用前，这一缓冲液需用去离子甲酰胺按 1：1 稀释，稀释后的溶液可储存于 -20℃。
14. 20X SSC 储存液：3 mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠（pH7.0 )。
15. 10% (m/V) SDS。
16. TBS：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 )，400 mmoI/L NaCl。
17. 封闭缓冲液：0.5%（m/V）封闭剂（RPN3023、Amersham International），溶于 TBS。
18. 抗荧光素-碱性磷酸醋酶结合物：可从 Amersham 公司购得。
19. 检测缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl ( pH 9.5)，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2。
20. NBT 溶液：50 mg/ml 硝基蓝四唑（niroblue tetrazolium，NBT）溶于二甲基甲酰胺。
21. BCIP 溶液：75 mg/ml 溴-氯-吲哚磷酸（bromo-chloro-indolyl phosphate，BCIP ) 溶于 70% ( V/V ) 二甲基甲酰胺。
二、操作方法
1. 探针标记
(1) 室温下于 1.5 ml 微量离心管中依次加入下列试剂：转录缓冲液 4 μl，0.2 mg/L DTT 1 μl，HPRI 20 U，核苷酸溶液 8 μl，线状 DNA 模板 1 μg，RNA 聚合酶 25 U，加水至终体积为 20 μl，轻轻混匀。
(2) 至少保温 2 h。不同的 RNA 聚合酶的保温温度不同，SP6 为 40℃，T3 和 T7 均为 37℃。
(3) 标记的 RNA 探针可储存于 -20℃。
2. 标记探针的纯化及加工
(1) 于 RNA 探针混合液中加入 10 U 无 RNase 的 DNase Ⅰ，37℃ 保温 10 min。
(2) 加入 20 μl 0.4 mol/L NaHCO3，20 μl 0.6mol/L Na2CO3，60 μl 灭菌水。轻轻混匀，于 60℃ 保温进行碱水解。保温时间依转录物的长度及所需探针的大小而定。
(3) 加入 1.3 μl 冰乙酸，20 μl 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 )，2 μl 10 mg/ml 酵母 tRNA，500 μl 乙醇，于 -20℃ 至少放置 2 h 以沉淀 RNA。
(4) 于微型离心机上用最高速度离心 15 min 沉淀 RNA，弃上清液。
(5) 用 70% 乙醇淋洗沉淀，保持 -20℃：离心 5 min，弃上清液。
(6) 用灭菌水溶解 RNA 探针，并调整 RNA 探针浓度为杂交所需浓度的 10~20 倍，于 -20℃ 保存。
3. 组织及细胞的预处理
用于原位杂交的所有组织可用中性缓冲的甲醛（4%) 固定，醛固定剂能很好的保留细胞 RNA，甲醛灌注动物或刚冰冻的组织切片应固定于室温下的甲醛中，未灌流的组织比灌流的组织更易于进行冰冻切片，更易于附着于载玻片上。
(1) 灌流的组织。
用普通盐水灌流动物以去除血红细胞，接着用约 200 ml 溶于 0.1 mol/L PBS 中的 4% 甲醛溶液灌洗动物，置于 20% 蔗糖 (溶于 PBS) 溶液中过夜。将组织冰冻于液氮中并储存于 -80℃。
在约 -20°C 将组织进行切片（10 μm 或更薄 ) 并将切片转移至经聚赖氨酸处理的载玻片上。于 -80℃ 储存组织切片。
(2) 未灌流的组织。
将新鲜组织冻干于液氮中或冻干保存于冷却至 -30°C 的异戊烷中。将组织进行切片并转至经聚赖氨酸处理的载玻片上。于 -80℃ 储存组织切片。
杂交前从 -80℃ 取出载玻片并于室温下直接置于 4% 甲醛中 1 h。用 PBS 或 2X SSC 彻底洗涤。
对于任何 ISH 实验，为取得成功的结果，此步最为重要。每一个杂交系统，均需要它自己的最佳预处理方案。预处理的设计根据这样一个原则：既能使探针与抗体的结合物便于接触到靶分子，又能使组织保持原有的形态结构，并使靶分于保持它原有的位置。另 外，预处理方案还可用于设置 ISH 所必需的一些对照实验。
4. 杂交和洗涤
杂交严格件的控制可通过杂交步骤屮的温度、盐浓度和平酰胺的浓度来控制。但是更方便的控制是将这些参数应用到杂交后的严格洗涤上。
(1) 杂交缓冲液于 37℃ 预热 15 min，按 1：1 比例用去离子甲酰胺稀释，充分混匀。
(2) 于杂交缓冲液中加入所需量经 55℃ 预热的探针。300~600 ng/ml 的探针浓度适用于大多数杂交。
(3) 用适当体积的杂交缓冲液/探针混合物覆盖切片。
(4) 将切片放在的电热板上，放置 3~6 min。保温时间取决于靶的类型。
(5) 置切片于湿盒中，按所需温度（典型的是 55℃ ) 及时间进行杂交。
(6) 按所需的严格程度洗涤玻片。典型的洗涤程序包括：1X SSC-0.1%(V/V) SDS 于室温洗两次，每次 5 min；0.2X SSC-0.1%(V/V) SDS 于 55°C 洗两次，每次 10 min。
(7) 为降低本底，可用 RNase 对 RNA 探针进一步处理。此步仅仅除去未杂交的单链探针。具体步骤如下：玻片于 2X SSC 中淋洗 2 min 后，于预热的 2X SSC 液（含 RNase A 10 μg/ml ) 37℃ 保温 20~30 min。在进行下一步骤之前，于 2X SSC 中淋洗玻片。
5. 封闭、抗体保温和洗涤
在以下一系列保温中均需轻轻晃动玻片，除非特别声明，否则均于室温下进行。注意：此处所用的 TBS 比标准 TBS 所含的盐浓度更高。
(1) 玻片于 TBS 中洗 5 min。
(2) 置玻片于封闭溶液中保温 1 h。
(3) 于 TBS 中淋洗玻片 1min，沥干玻片上的缓冲液，如有必要，吸干每张玻片表面切片周围的液体。
(4) 按 1：10000 比例，用含 0.5%( m/V ) BSA 组分 V 的 TBS 稀释抗荧光素碱性磷酸酯酶结合物。用抗体覆盖薄片（每张玻片通常用 100 μl），静置保温 1 h。
(5) 玻片于 TBS 中洗 3 次，每次 5 min。
6. 检测
(1) 玻片于检测缓冲液中洗 5 min，沥干每一张玻片上的液体，如有必要，吸干玻片表面切片周围的液体。
(2) 取 45 μl NBT 储存液和 35 μl BCIP 储存液加至 10 ml 检测缓冲液中。每张切片加 500 μl 检测试剂，置于暗处显色 4~24 h。
(3) 用蒸馏水淋洗玻片两次，每次 2 min。
(4) 如需要，进行复染。加上封片剂，并盖上盖玻片。
(5) 于光学显微镜下观察结果。
1. 转录缓冲液：200 mmol/I Tris-HCl ( pH 7.5 )，30 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 亚精胺，0.5%（m/V）BSA。
2. 人胎盘核糖核酸酶抑制剂（human placental ribonuclease inhibitor, HPRT) : 20 U/μl。
3. 2 mmol/L DTT : 新鲜配制，过滤除菌。
4. 线状 DNA 模板：通常 0.5~1 μg/μl。
5. SP6，T7 或 T3RNA 聚合酶。
6. 核苷酸溶液：1.25 mmol/L ATP、1.25 mmol/L GTP、1.25 mmol/L CTP、0.312 mmol/L UTP、0. 312 mmol/L 荧光素-11-UTP 溶于灭菌水。
7. 无 RNase 的 DNaseⅠ：用灭菌水新鲜配制，稀释至 10 U/ 80 μl。
8. 4 mol/L NaHCO3，高压灭菌。
9. 6 mol/L NaHCO3，高压灭菌。
10. 冰乙酸。
11. 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2）高压灭菌。
12. 10 mg/ml 酵母 tRNA。
13. 杂交缓冲液：可用标准杂交缓冲液。这里推荐一种优化缓冲液成品，可从 Amersham 公句购得。缓冲液由以下成分组成： 4XSSC，600 μg/ml 鲑鱼精 DNA，2X Denhardt 溶液。此杂交缓冲液还含有一种用于提高杂交效率的专利化合物。在使用前，这一缓冲液需用去离子甲酰胺按 1：1 稀释，稀释后的溶液可储存于 -20℃。
14. 20X SSC 储存液：3 mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠（pH7.0 )。
15. 10% (m/V) SDS。
16. TBS：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 )，400 mmoI/L NaCl。
17. 封闭缓冲液：0.5%（m/V）封闭剂（RPN3023、Amersham International），溶于 TBS。
18. 抗荧光素-碱性磷酸醋酶结合物：可从 Amersham 公司购得。
19. 检测缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl ( pH 9.5)，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2。
20. NBT 溶液：50 mg/ml 硝基蓝四唑（niroblue tetrazolium，NBT）溶于二甲基甲酰胺。
21. BCIP 溶液：75 mg/ml 溴-氯-吲哚磷酸（bromo-chloro-indolyl phosphate，BCIP ) 溶于 70% ( V/V ) 二甲基甲酰胺。
二、操作方法
1. 探针标记
(1) 室温下于 1.5 ml 微量离心管中依次加入下列试剂：转录缓冲液 4 μl，0.2 mg/L DTT 1 μl，HPRI 20 U，核苷酸溶液 8 μl，线状 DNA 模板 1 μg，RNA 聚合酶 25 U，加水至终体积为 20 μl，轻轻混匀。
(2) 至少保温 2 h。不同的 RNA 聚合酶的保温温度不同，SP6 为 40℃，T3 和 T7 均为 37℃。
(3) 标记的 RNA 探针可储存于 -20℃。
2. 标记探针的纯化及加工
(1) 于 RNA 探针混合液中加入 10 U 无 RNase 的 DNase Ⅰ，37℃ 保温 10 min。
(2) 加入 20 μl 0.4 mol/L NaHCO3，20 μl 0.6mol/L Na2CO3，60 μl 灭菌水。轻轻混匀，于 60℃ 保温进行碱水解。保温时间依转录物的长度及所需探针的大小而定。
(3) 加入 1.3 μl 冰乙酸，20 μl 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 )，2 μl 10 mg/ml 酵母 tRNA，500 μl 乙醇，于 -20℃ 至少放置 2 h 以沉淀 RNA。
(4) 于微型离心机上用最高速度离心 15 min 沉淀 RNA，弃上清液。
(5) 用 70% 乙醇淋洗沉淀，保持 -20℃：离心 5 min，弃上清液。
(6) 用灭菌水溶解 RNA 探针，并调整 RNA 探针浓度为杂交所需浓度的 10~20 倍，于 -20℃ 保存。
3. 组织及细胞的预处理
用于原位杂交的所有组织可用中性缓冲的甲醛（4%) 固定，醛固定剂能很好的保留细胞 RNA，甲醛灌注动物或刚冰冻的组织切片应固定于室温下的甲醛中，未灌流的组织比灌流的组织更易于进行冰冻切片，更易于附着于载玻片上。
(1) 灌流的组织。
用普通盐水灌流动物以去除血红细胞，接着用约 200 ml 溶于 0.1 mol/L PBS 中的 4% 甲醛溶液灌洗动物，置于 20% 蔗糖 (溶于 PBS) 溶液中过夜。将组织冰冻于液氮中并储存于 -80℃。
在约 -20°C 将组织进行切片（10 μm 或更薄 ) 并将切片转移至经聚赖氨酸处理的载玻片上。于 -80℃ 储存组织切片。
(2) 未灌流的组织。
将新鲜组织冻干于液氮中或冻干保存于冷却至 -30°C 的异戊烷中。将组织进行切片并转至经聚赖氨酸处理的载玻片上。于 -80℃ 储存组织切片。
杂交前从 -80℃ 取出载玻片并于室温下直接置于 4% 甲醛中 1 h。用 PBS 或 2X SSC 彻底洗涤。
对于任何 ISH 实验，为取得成功的结果，此步最为重要。每一个杂交系统，均需要它自己的最佳预处理方案。预处理的设计根据这样一个原则：既能使探针与抗体的结合物便于接触到靶分子，又能使组织保持原有的形态结构，并使靶分于保持它原有的位置。另 外，预处理方案还可用于设置 ISH 所必需的一些对照实验。
4. 杂交和洗涤
杂交严格件的控制可通过杂交步骤屮的温度、盐浓度和平酰胺的浓度来控制。但是更方便的控制是将这些参数应用到杂交后的严格洗涤上。
(1) 杂交缓冲液于 37℃ 预热 15 min，按 1：1 比例用去离子甲酰胺稀释，充分混匀。
(2) 于杂交缓冲液中加入所需量经 55℃ 预热的探针。300~600 ng/ml 的探针浓度适用于大多数杂交。
(3) 用适当体积的杂交缓冲液/探针混合物覆盖切片。
(4) 将切片放在的电热板上，放置 3~6 min。保温时间取决于靶的类型。
(5) 置切片于湿盒中，按所需温度（典型的是 55℃ ) 及时间进行杂交。
(6) 按所需的严格程度洗涤玻片。典型的洗涤程序包括：1X SSC-0.1%(V/V) SDS 于室温洗两次，每次 5 min；0.2X SSC-0.1%(V/V) SDS 于 55°C 洗两次，每次 10 min。
(7) 为降低本底，可用 RNase 对 RNA 探针进一步处理。此步仅仅除去未杂交的单链探针。具体步骤如下：玻片于 2X SSC 中淋洗 2 min 后，于预热的 2X SSC 液（含 RNase A 10 μg/ml ) 37℃ 保温 20~30 min。在进行下一步骤之前，于 2X SSC 中淋洗玻片。
5. 封闭、抗体保温和洗涤
在以下一系列保温中均需轻轻晃动玻片，除非特别声明，否则均于室温下进行。注意：此处所用的 TBS 比标准 TBS 所含的盐浓度更高。
(1) 玻片于 TBS 中洗 5 min。
(2) 置玻片于封闭溶液中保温 1 h。
(3) 于 TBS 中淋洗玻片 1min，沥干玻片上的缓冲液，如有必要，吸干每张玻片表面切片周围的液体。
(4) 按 1：10000 比例，用含 0.5%( m/V ) BSA 组分 V 的 TBS 稀释抗荧光素碱性磷酸酯酶结合物。用抗体覆盖薄片（每张玻片通常用 100 μl），静置保温 1 h。
(5) 玻片于 TBS 中洗 3 次，每次 5 min。
6. 检测
(1) 玻片于检测缓冲液中洗 5 min，沥干每一张玻片上的液体，如有必要，吸干玻片表面切片周围的液体。
(2) 取 45 μl NBT 储存液和 35 μl BCIP 储存液加至 10 ml 检测缓冲液中。每张切片加 500 μl 检测试剂，置于暗处显色 4~24 h。
(3) 用蒸馏水淋洗玻片两次，每次 2 min。
(4) 如需要，进行复染。加上封片剂，并盖上盖玻片。
(5) 于光学显微镜下观察结果。
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