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RNA实验

5.7 RNA 原位杂交

2024-06-20 RNA实验 加入收藏
原理原位杂交的原理是含有互补序列(探针)的被标记的单链 DNA 或 RNA 片段在适当 的条件下与细胞的 DNA 或 RNA 杂交形成稳定的杂交体。无论是 DN


原理

原位杂交的原理是含有互补序列(探针)的被标记的单链 DNA 或 RNA 片段在适当 的条件下与细胞的 DNA 或 RNA 杂交形成稳定的杂交体。无论是 DNA( dsDNA、寡核苷酸和 ssDNA ) 或是 RNA( SSC RNA) 探针均能用于定位 DNA 和 mRNA,并且均能用于两 个主要类型的标记策略:直接标记,即用报道分子(如同位素)附着于 DNA 或 RNA;间接标记,在该法中将半抗原(如生物素或地高辛)附着于探针上,然后用标记的结合蛋白 (如亲合素)检测或者用特异性的抗体检测靶探针杂交体。这些基本步骤是相互依赖的,为了得到最佳结果,前面步骤中的任何一个变化均要求以后的步骤作出相应的变化。事实上 对于许多组织化学的步骤来说,一个给定系统的“理想方法”肯定是靠大量实践检验建立起来的。

材料与仪器

线状 DNA 模板 DNaseⅠ 抗荧光素-碱性磷酸醋酶结合物
转录缓冲液 人胎盘核糖核酸酶抑制剂 DTT 核苷酸溶液 冰乙酸 NaHCO3 乙酸钠 酵母 tRNA 杂交缓冲液 SSC储存液 封闭缓冲液 检测缓冲液 NBT溶液 BCIP溶液

步骤

一、材料与设备

1. 转录缓冲液:200 mmol/I Tris-HCl ( pH 7.5 ),30 mmol/L MgCl2,10 mmol/L 亚精胺,0.5%(m/V)BSA。

2. 人胎盘核糖核酸酶抑制剂(human placental ribonuclease inhibitor, HPRT) : 20 U/μl。

3. 2 mmol/L DTT : 新鲜配制,过滤除菌。

4. 线状 DNA 模板:通常 0.5~1 μg/μl。

5. SP6,T7 或 T3RNA 聚合酶。

6. 核苷酸溶液:1.25 mmol/L ATP、1.25 mmol/L GTP、1.25 mmol/L CTP、0.312 mmol/L UTP、0. 312 mmol/L 荧光素-11-UTP 溶于灭菌水。

7. 无 RNase 的 DNaseⅠ:用灭菌水新鲜配制,稀释至 10 U/ 80 μl。

8. 4 mol/L NaHCO3,高压灭菌。

9. 6 mol/L NaHCO3,高压灭菌。

10. 冰乙酸。

11. 3 mol/L 乙酸钠(pH 5.2)高压灭菌。

12. 10 mg/ml 酵母 tRNA。

13. 杂交缓冲液:可用标准杂交缓冲液。这里推荐一种优化缓冲液成品,可从 Amersham 公句购得。缓冲液由以下成分组成: 4XSSC,600 μg/ml 鲑鱼精 DNA,2X Denhardt 溶液。此杂交缓冲液还含有一种用于提高杂交效率的专利化合物。在使用前,这一缓冲液需用去离子甲酰胺按 1:1 稀释,稀释后的溶液可储存于 -20℃。

14. 20X SSC 储存液:3 mol/L NaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠(pH7.0 )。

15. 10% (m/V) SDS。

16. TBS:100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5 ),400 mmoI/L NaCl。

17. 封闭缓冲液:0.5%(m/V)封闭剂(RPN3023、Amersham International),溶于 TBS。

18. 抗荧光素-碱性磷酸醋酶结合物:可从 Amersham 公司购得。

19. 检测缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl ( pH 9.5),100 mmol/L NaCl,10 mmol/L MgCl2

20. NBT 溶液:50 mg/ml 硝基蓝四唑(niroblue tetrazolium,NBT)溶于二甲基甲酰胺。

21. BCIP 溶液:75 mg/ml 溴-氯-吲哚磷酸(bromo-chloro-indolyl phosphate,BCIP ) 溶于 70% ( V/V ) 二甲基甲酰胺。

二、操作方法

1. 探针标记

(1) 室温下于 1.5 ml 微量离心管中依次加入下列试剂:转录缓冲液 4 μl,0.2 mg/L DTT 1 μl,HPRI 20 U,核苷酸溶液 8 μl,线状 DNA 模板 1 μg,RNA 聚合酶 25 U,加水至终体积为 20 μl,轻轻混匀。

(2) 至少保温 2 h。不同的 RNA 聚合酶的保温温度不同,SP6 为 40℃,T3 和 T7 均为 37℃。

(3) 标记的 RNA 探针可储存于 -20℃。

2. 标记探针的纯化及加工

(1) 于 RNA 探针混合液中加入 10 U 无 RNase 的 DNase Ⅰ,37℃ 保温 10 min。

(2) 加入 20 μl 0.4 mol/L NaHCO3,20 μl 0.6mol/L Na2CO3,60 μl 灭菌水。轻轻混匀,于 60℃ 保温进行碱水解。保温时间依转录物的长度及所需探针的大小而定。

(3) 加入 1.3 μl 冰乙酸,20 μl 3 mol/L 乙酸钠(pH 5.2 ),2 μl 10 mg/ml 酵母 tRNA,500 μl 乙醇,于 -20℃ 至少放置 2 h 以沉淀 RNA。

(4) 于微型离心机上用最高速度离心 15 min 沉淀 RNA,弃上清液。

(5) 用 70% 乙醇淋洗沉淀,保持 -20℃:离心 5 min,弃上清液。

(6) 用灭菌水溶解 RNA 探针,并调整 RNA 探针浓度为杂交所需浓度的 10~20 倍,于 -20℃ 保存。

3. 组织及细胞的预处理

用于原位杂交的所有组织可用中性缓冲的甲醛(4%) 固定,醛固定剂能很好的保留细胞 RNA,甲醛灌注动物或刚冰冻的组织切片应固定于室温下的甲醛中,未灌流的组织比灌流的组织更易于进行冰冻切片,更易于附着于载玻片上。

(1) 灌流的组织。

用普通盐水灌流动物以去除血红细胞,接着用约 200 ml 溶于 0.1 mol/L PBS 中的 4% 甲醛溶液灌洗动物,置于 20% 蔗糖 (溶于 PBS) 溶液中过夜。将组织冰冻于液氮中并储存于 -80℃。

在约 -20°C 将组织进行切片(10 μm 或更薄 ) 并将切片转移至经聚赖氨酸处理的载玻片上。于 -80℃ 储存组织切片。

(2) 未灌流的组织。

将新鲜组织冻干于液氮中或冻干保存于冷却至 -30°C 的异戊烷中。将组织进行切片并转至经聚赖氨酸处理的载玻片上。于 -80℃ 储存组织切片。

杂交前从 -80℃ 取出载玻片并于室温下直接置于 4% 甲醛中 1 h。用 PBS 或 2X SSC 彻底洗涤。

对于任何 ISH 实验,为取得成功的结果,此步最为重要。每一个杂交系统,均需要它自己的最佳预处理方案。预处理的设计根据这样一个原则:既能使探针与抗体的结合物便于接触到靶分子,又能使组织保持原有的形态结构,并使靶分于保持它原有的位置。另 外,预处理方案还可用于设置 ISH 所必需的一些对照实验。

4. 杂交和洗涤

杂交严格件的控制可通过杂交步骤屮的温度、盐浓度和平酰胺的浓度来控制。但是更方便的控制是将这些参数应用到杂交后的严格洗涤上。

(1) 杂交缓冲液于 37℃ 预热 15 min,按 1:1 比例用去离子甲酰胺稀释,充分混匀。

(2) 于杂交缓冲液中加入所需量经 55℃ 预热的探针。300~600 ng/ml 的探针浓度适用于大多数杂交。

(3) 用适当体积的杂交缓冲液/探针混合物覆盖切片。

(4) 将切片放在的电热板上,放置 3~6 min。保温时间取决于靶的类型。

(5) 置切片于湿盒中,按所需温度(典型的是 55℃ ) 及时间进行杂交。

(6) 按所需的严格程度洗涤玻片。典型的洗涤程序包括:1X SSC-0.1%(V/V) SDS 于室温洗两次,每次 5 min;0.2X SSC-0.1%(V/V) SDS 于 55°C 洗两次,每次 10 min。

(7) 为降低本底,可用 RNase 对 RNA 探针进一步处理。此步仅仅除去未杂交的单链探针。具体步骤如下:玻片于 2X SSC 中淋洗 2 min 后,于预热的 2X SSC 液(含 RNase A 10 μg/ml ) 37℃ 保温 20~30 min。在进行下一步骤之前,于 2X SSC 中淋洗玻片。

5. 封闭、抗体保温和洗涤

在以下一系列保温中均需轻轻晃动玻片,除非特别声明,否则均于室温下进行。注意:此处所用的 TBS 比标准 TBS 所含的盐浓度更高。

(1) 玻片于 TBS 中洗 5 min。

(2) 置玻片于封闭溶液中保温 1 h。

(3) 于 TBS 中淋洗玻片 1min,沥干玻片上的缓冲液,如有必要,吸干每张玻片表面切片周围的液体。

(4) 按 1:10000 比例,用含 0.5%( m/V ) BSA 组分 V 的 TBS 稀释抗荧光素碱性磷酸酯酶结合物。用抗体覆盖薄片(每张玻片通常用 100 μl),静置保温 1 h。

(5) 玻片于 TBS 中洗 3 次,每次 5 min。

6. 检测

(1) 玻片于检测缓冲液中洗 5 min,沥干每一张玻片上的液体,如有必要,吸干玻片表面切片周围的液体。

(2) 取 45 μl NBT 储存液和 35 μl BCIP 储存液加至 10 ml 检测缓冲液中。每张切片加 500 μl 检测试剂,置于暗处显色 4~24 h。

(3) 用蒸馏水淋洗玻片两次,每次 2 min。

(4) 如需要,进行复染。加上封片剂,并盖上盖玻片。

(5) 于光学显微镜下观察结果。


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