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RNA实验

RNase A/Tl 保护和 RNase H 聚焦法实验(RNase H 聚焦法)

2024-06-20 RNA实验 加入收藏
原理RNA与互补的 [ 32P ] 标记的探针在溶液中复件后形成的 RNA-RNA 杂合分子对单链专一的 RNase 具有抗性。此法可以对 RNA 分子末端进行


原理

RNA与互补的 [ 32P ] 标记的探针在溶液中复件后形成的 RNA-RNA 杂合分子对单链专一的 RNase 具有抗性。此法可以对 RNA 分子末端进行定位或对含内含子的交界定位。与 Northern blot 相比,它是一种十分有效而且灵敏度很高的并可用于测定 mRNA 丰度的方法。杂交过程中加入过量的探针能使所有互补序列形成标记的杂合分子。未杂交探引和已杂交探针的单链部分则被消化而清除。“被保护的”探针通过变性 的聚丙烯酰胺凝胶来检测并定量。最初是用 DNA 单链作为探针,但是单链 DNA 的制备耗时多。又因为标记 RNA非常容易,所以根据 RNA-RNA 杂交进行测定十分有利。

材料与仪器

RNase酶切混合物
工具酶 杂交缓冲液 加样终止缓冲液 TBE缓冲液 RNA探针
水浴 垂直电泳装置 电转移装置 杂交管 杂交炉 暗片盒 X射线片 尼龙膜

步骤

一、材料与设备

1. 水浴。

2. 垂直电泳装置。

3. 电转移装置 。

4. 杂交管。

5. 杂交炉。

6. 暗片盒。

7. X 射线片。

8. 尼龙膜。

9. 工具酶:RNase A、RNase T1、RNase H 和蛋白酶 K。

10. 杂交缓冲液:40 mmol/L PIPES ( pH 6.4 ),1 mmol/L EDTA,0.4 mol/L NaCl,80% 甲酰胺。

11. RNase 酶切混合物:0.3 mol/L NaCl,10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 ),5 mmol/L EDTA,90 U/ml RNase T1,40 μg/ml RNase A。

12. 加样终止缓冲液:20 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ),95% 甲醜胺,0.5 mg/ml 二甲苯青 FF,0.5 mg/ml 溴酚蓝。

13. TBE 缓冲液:0.5 mol/L Tris-硼酸(pH 8.3 ),10 mmol/L EDTA。

14. [ 32P ] 标记的 RNA 探针。

二、操作方法

1. 按照引物延伸法将单链寡核苷酸 DNA 与靶 RNA 退火。

2. 制备下列混合物:退火反应物 15 μl,100 mmol/L MgCl2 2.25 μl,10 mmol/L DTT 4.5 μl,RNase H 1.5 μl(6U),加水至终体积为 45 μl。

3. 将混合物于 37℃ 1 h,加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA 以终止反应,并于 37℃ 反应 10 min 以灭活 RNase H。

4. 加入 55 加人 55 μl TE,并用 1/20 体积 4.5 mol/L NaAc ( pH 6.0) 和 2.5 倍体积冷的 95% 乙醇于 -20 ℃ 过夜沉淀 RNA。

5. 以 12000 g 离心 15 min,4℃ 回收RNA,用70%乙醇洗涤沉淀,12000 g 离心 10 min,在旋转真空冷冻干燥器中干燥沉淀。RNase H 酶切的 RNA 片段既可用 RNA 作图中引物延伸中 5' 端标记的方法加以检测,也可用 Northern 印迹方法进行检测。

6. 用 3 μl H2O 重悬沉淀,加入 3 μl 加样终止缓冲液并迸行变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

7. 电泳结束,将凝胶浸入 0.5X TBE 缓冲液中 15 min。安置一个将 RNA 从凝胶转移至膜转移用的“滤纸一凝胶一尼龙膜”的“夹层”,确保在膜和凝胶之间没有产生气泡。

8. 将上述的“夹层”插入含有冷的 0.5X TBE 缓冲液的转移装置中,使膜置于凝胶和阳极之间。

9. 电印迹使 RNA 从凝胶转移至膜上。电印迹的条件将根据 RNA 分子大小和凝胶尺寸而变化。通常对于一个 14 cmX 18 cm 聚丙烯酰胺凝胶,小于 1000 nt 的 RNA,以 500 mA (U=65V) 印迹 3 h 即可发生完全的转移。

10. 在 0.5 X TBE 缓冲液中洗膜 5 min,并将膜晾干。

11. 在真空烘箱中于 80℃ 烤 2 h 或用 UV 交联机照射使 RNA 与膜发生交联,然后按照 Northern 印迹章节中所述的方法用适当的探针通过杂交检测 RNA 片段。


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