体外转录与体外翻译耦联的快速反应系统
材料与仪器质粒 DNA 模板无核酸酶污染的水 [35S] 标记的甲硫氧酸 TNT 快速超级混合液 T7TNTPCR 增强液一 70C 冰箱 冰浴 微量移液器 离
材料与仪器
质粒 DNA 模板
无核酸酶污染的水 [35S] 标记的甲硫氧酸 TNT 快速超级混合液 T7TNTPCR 增强液
一 70°C 冰箱 冰浴 微量移液器 离心机 水浴槽 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置
无核酸酶污染的水 [35S] 标记的甲硫氧酸 TNT 快速超级混合液 T7TNTPCR 增强液
一 70°C 冰箱 冰浴 微量移液器 离心机 水浴槽 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置
步骤
―、材料与设备
1) 无核酸酶污染的水。
2)[35S] 标记的甲硫氧酸.:1X105mol/L,lOOOCi/mmol
3) 质粒 DNA 模板
4)TNT 快速超级混合液：主要包括 TNT-兔网织红细胞裂解物，TNT 反应缓冲液，TNTRNA 聚合酶，核苷二磷酸混合液，l0 mmol/L 精胺和 RNasin(30〜60U)。
5)T7TNTPCR 增强液
6) 一 70°C 冰箱
7) 冰浴
8) 微量移液器
9) 离心机
10) 水浴槽
11) 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置
二、操作方法
(-）以质粒 DNA 为模板进行体外转录/翻译
1) 将 TNT 快速超级混合液从一 70℃ 冰箱中取出后，手握反应管以使其尽快融化。当 TNT 快速超级混合液融化后，将其置于冰上其他组分可在室温屮融化，然后置于冰上。
2) 参照表 4.4 中的反应体系，于 0.5 ml 或 1.5 ml 的离心管中加入反应混合物，在加入所有的组分之耵，用移液枪轻轻上下吹打混匀。如有必要，可将离心管进行短时的离心以使反应混合物聚集到管的底端。
3) 应设立一个不加入 DNA 的空白对照反应, 此对照反应可用于测量含有放射性标记的氨基酸的反应的背景，
4) 将反应管置于 30℃ 孵育 60〜90 min
5) 分析翻译结果。通过对产物中的放射性标记的氨基酸利用闪烁计数仪进行测定及对翻译产物的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，从而鉴定翻译结果。
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(二）以 PCR 产物为模板进行体外转录/翻译
具体操作步骤 H 八-) 以质粒为模板进行体外转录/翻译」中的 1)〜5)。
反应
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1) 无核酸酶污染的水。
2)[35S] 标记的甲硫氧酸.:1X105mol/L,lOOOCi/mmol
3) 质粒 DNA 模板
4)TNT 快速超级混合液：主要包括 TNT-兔网织红细胞裂解物，TNT 反应缓冲液，TNTRNA 聚合酶，核苷二磷酸混合液，l0 mmol/L 精胺和 RNasin(30〜60U)。
5)T7TNTPCR 增强液
6) 一 70°C 冰箱
7) 冰浴
8) 微量移液器
9) 离心机
10) 水浴槽
11) 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置
二、操作方法
(-）以质粒 DNA 为模板进行体外转录/翻译
1) 将 TNT 快速超级混合液从一 70℃ 冰箱中取出后，手握反应管以使其尽快融化。当 TNT 快速超级混合液融化后，将其置于冰上其他组分可在室温屮融化，然后置于冰上。
2) 参照表 4.4 中的反应体系，于 0.5 ml 或 1.5 ml 的离心管中加入反应混合物，在加入所有的组分之耵，用移液枪轻轻上下吹打混匀。如有必要，可将离心管进行短时的离心以使反应混合物聚集到管的底端。
3) 应设立一个不加入 DNA 的空白对照反应, 此对照反应可用于测量含有放射性标记的氨基酸的反应的背景，
4) 将反应管置于 30℃ 孵育 60〜90 min
5) 分析翻译结果。通过对产物中的放射性标记的氨基酸利用闪烁计数仪进行测定及对翻译产物的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，从而鉴定翻译结果。
(二）以 PCR 产物为模板进行体外转录/翻译
具体操作步骤 H 八-) 以质粒为模板进行体外转录/翻译」中的 1)〜5)。
反应
注意事项
1) 通过 TNT 耦联网织红细胞裂解物翻译蛋白质的获得率和模板有关。在 50ul 的反应体积屮阳性对照质粒叶产生 150〜500ng 的蛋白质。
2)—次标准反应的 DNA 的用量为 1ug。-般用 0.2〜2.0ug 的 DNA 可得到满意的结果。当 DNA 的量大于 lug 时并不增加蛋白质的产量。
3) 每个 TNT 兔网织红细胞裂解物系统中的组分均作了不同的设计. 各组分都作了最优的配力、替换一个组分将会降低得率。比如不能在一个给定的系统中用下 T7RMA 聚合酶替换 SP6RNA 聚合酶。每一个系统的反应中，在 RNA 聚合酶的量一定的情况下，用别的 RNA 聚合酶会导致得率低
4) 用于 TNT 耦联网织红细胞裂解物系统翻洋的模板的插人片段必须克隆在-个 SP6、T3、T7RNA 聚合酶启动子的下游，在合适的翻泽读码框中还冇一个 ATG。其他一些序列会影响最终得率，如起始密码子前后序列效应，5＇和 3＇非翻译序列，5＇帽子类似物等。如果在编码区上游含奋如 EMCVmRNA 的内核糖体进人位点或 3＇未端含有 Poly(A), 均可增加翻泽效率。加 m＇G(5)ppP(5)G 类似物则会抑制 TNT 耦联网织红细胞裂解物的翻译，因为这一游离类似物可与翻译起始因子结合。
5）用 TNT 耦联兔网织红细胞裂解物能得到的最大的蛋白质约为 176kDa
6) 在 TNT 耦联网织红细胞裂解物系统屮，环型 DNA 和 3 种 RNA 聚合酶均能冇效配套，而线状 DNA 只适用于 T3、T7 系统，用 SPSRNA 聚合酶的翻译效率则大大降低。如用线状 (比如 TNTT7 快速耦联转录/翻译系统），应在 RNA 聚合酶肩动子的上游有20bp 的序列，以使启动子的结合冇效.
2)—次标准反应的 DNA 的用量为 1ug。-般用 0.2〜2.0ug 的 DNA 可得到满意的结果。当 DNA 的量大于 lug 时并不增加蛋白质的产量。
3) 每个 TNT 兔网织红细胞裂解物系统中的组分均作了不同的设计. 各组分都作了最优的配力、替换一个组分将会降低得率。比如不能在一个给定的系统中用下 T7RMA 聚合酶替换 SP6RNA 聚合酶。每一个系统的反应中，在 RNA 聚合酶的量一定的情况下，用别的 RNA 聚合酶会导致得率低
4) 用于 TNT 耦联网织红细胞裂解物系统翻洋的模板的插人片段必须克隆在-个 SP6、T3、T7RNA 聚合酶启动子的下游，在合适的翻泽读码框中还冇一个 ATG。其他一些序列会影响最终得率，如起始密码子前后序列效应，5＇和 3＇非翻译序列，5＇帽子类似物等。如果在编码区上游含奋如 EMCVmRNA 的内核糖体进人位点或 3＇未端含有 Poly(A), 均可增加翻泽效率。加 m＇G(5)ppP(5)G 类似物则会抑制 TNT 耦联网织红细胞裂解物的翻译，因为这一游离类似物可与翻译起始因子结合。
5）用 TNT 耦联兔网织红细胞裂解物能得到的最大的蛋白质约为 176kDa
6) 在 TNT 耦联网织红细胞裂解物系统屮，环型 DNA 和 3 种 RNA 聚合酶均能冇效配套，而线状 DNA 只适用于 T3、T7 系统，用 SPSRNA 聚合酶的翻译效率则大大降低。如用线状 (比如 TNTT7 快速耦联转录/翻译系统），应在 RNA 聚合酶肩动子的上游有20bp 的序列，以使启动子的结合冇效.
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