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RNA实验

原核细胞体外翻译系统

2024-06-20 RNA实验 加入收藏
材料与仪器适用于杯状 DNA 的 S30 提取物 适用于线状 DNA 的 S30 提取物 适用于环状 DNA 的 T7S30 提取物无核酸酶的水 [35S] 标


材料与仪器

适用于杯状 DNA 的 S30 提取物 适用于线状 DNA 的 S30 提取物 适用于环状 DNA 的 T7S30 提取物
无核酸酶的水 [35S] 标记的甲硫氨酸 1 mmol L 缺少中硫氨酸的氨基酸混合物 缺少氨基酸的 S30 反应混合液
—70℃ 冰箱 微量移液器 离心机 冰浴

步骤

―、材料与设备

1) 无核酸酶的水。

2)[35S] 标记的甲硫氨酸(1.25×10-5mol/L12000Ci/mmol)

3)1 mmol/L 缺少中硫氨酸的氨基酸混合物

4) 缺少氨基酸的 S30 反应混合液(Promega 公司)

5) 适用于杯状 DNA 的 S30 提取物(Promega 公司)

6) 适用于线状 DNA 的 S30 提取物 (Promega 公司)

7) 适用于环状 DNA 的 T7S30 提取物 (Promega 公司)

8)—70℃ 冰箱

9) 微量移液器

10) 离心机

11) 冰浴

二、操作方法

(一)适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统
          
      
2)轻轻涡旋,然后离心 5s, 以使反应混合物沉入管底。

3)37℃ 孵育 1〜2 h。

4) 将反应管置于冰浴上 5 min, 以终止反应。

5) 分析试验结果。利用三氯乙酸(TCA) 免疫沉淀实验和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以分析产物,

(二)适用于对线状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统

具体操作步骤同「(一)适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统」中的 1)〜5)。反应体系如表 4.2 所示



(三) 适用于对环状 DNA 迸行体外翻译的大肠杆菌 T7S30 提取物系统

具体操作步骤同「一)适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统」中的 1)〜5),反应体系如表 4.3 所示;

注意事项

1)DNA 用量的优化。逋常,一个反应体系屮不应包含超过 4ug 的 DNA。因为随 DNA 的不断增加将会导致较多的未掺入标记氨基酸的目的蛋白的产生、从序列内部起始翻译反应的增加以及过¥结朵翻译的产物的不断增加。

2) 因为 S 标记的氨基酸极易被鉍化成亚砜类而失去活性,故应将 [35S] 标记的甲硫氨酸分装后保存于一 70℃, 每次融化后使用,以取得最好的反应结果。

3) 模板 DNA 和水的纯度是非常重要的。如果翻译效率低下,则应检查水与模板的纯度。

4) 反应可在 24〜37℃ 的温度范闱内进行,37°C 时反应速度最快,需时约 2 h。较低的温度会导致较低的催化速率,且反应时间会相应延长数小时。假如在 37°C 反应 lh 没冇产牛预期的结果,则应尝试在低温反应较长的时间,这样有利于增加蛋白的表达量和蛋白表达的特异性。


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