Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > 细胞技术

细胞技术

高效感受态细胞制备

2024-09-19 细胞技术 加入收藏
方法一:效率非常高,一般可到10*8,好时可到10*9,特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。实验试剂:A液:1M,MnCl2B液:1M,HEPES,

方法一:

效率非常高,一般可到10*8,好时可到10*9,特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

实验试剂:

A液:1M,MnCl2

B液:1M,HEPES,pH=6.2-6.8,用无菌水配,配后不需灭菌;

C液 称取CaCl2 0.10g,KCl 1.18g,全部转入细口试剂瓶,然后加入46ml三蒸水,轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎,然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

取1管B液(0.6ml),全部加入C液(46ml)中,混匀后,再用1ml移液器加入3.3ml A液,混匀冰浴即可使用。

实验步骤:

1、 划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时。

2、 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡(300 rpms)培养3-4小时。

3、 将培养温度调至18℃剧烈振荡(3280 rpms)培养,其余与普通感受态差不多。

4、 每管加入4ml TB缓冲液,轻轻振荡,使菌体重新悬浮。

5、 加入280ml DMSO(可用国产分析纯),混匀后分装入1.5ml EP管,冰上静置15分钟。

6、 用纱布将所有装有感受态的EP管包好,用棉线系好后放入液氮中速冻,在液氮中静置12小时以上。

7、 取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

注意事项:

1、 洁净是最重要的。无菌都无所谓,在操作台上可正常操作。

2、 离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。

3、 涂板不要觉得不匀而多次反复,轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可,特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。

4、 涂完后建议空气晾干(20-30分钟)这样会减少卫星菌落出现。

5、 预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要。

方法二:

本法效率极高,建议大家采纳。

实验步骤:

1、 液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落。

2、 挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率。

3、 在18度 150-250RPM 培养19-50小时。没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度。

4、 OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟。

5、 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体。

6、 去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟。

7、 再次离心回收菌体。

8、 用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上。

9、 在液氮或-80度保存。

10、 将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上,37℃培养活化。

11、 挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基,18℃,200-250rpm培养。

12、 当OD600=0.5-0.8时,用预冷的40mL离心管于4℃,8000rpm离心10min,收集菌体。

13、 用预冷的TB Buffer重悬菌体,4℃,8000rpm离心10min,收集菌体。

14、 重复第4步操作。

15、 用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体,缓慢加入DMSO至终浓度7% 。

16、 冰浴10min后,分装保存于液氮中。


文章底部广告位

文章评论

加载中~