用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

下面的简单方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生 5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案Ｉ快速， 重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。1）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。

为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞ml，可每隔 20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大 肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各黧度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读 数得到标化。2）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。3）于４℃用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。4）倒出培养液，将管倒置１分钏以使最后残留的痕量培养液流尽。5）以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。我们发现将１mol/L CaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀 释至100mlk，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用 TFB（见表1.3）代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。6）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。7）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。8）每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，见表1.3和步骤５）注]重悬每份细胞沉淀。此时，可将细胞分成小份，放于-70℃冻存[有关讨论请参见53页本节（二）步骤 11)b.c)]。在这些条件下，尽管长期保存后转化效率会稍有下降，但细胞仍可保持处于感受态。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明细胞可 以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小时内，转化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。9）用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加ＤＮＡ（体积∞10μl，ＤＮＡ∞50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。10）将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。11）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。12）每管加800μlＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水溶将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞（转速不超过225转/分）。13）将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10μl）。可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表 面。如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞，然后用适量ＳＯＣ轻轻重悬细胞。

如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混合 物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青霉素抗性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上。氨苄青霉素抗性功的 增加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长掏物质的缘故。14）将平板置于室温直至液体被吸收。15）倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺增板时密度较低（每个90mm平板不超过104菌落）， 于37℃培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。

这样，铺平板时密度太高或 培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60μg/ml增至100μg /ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。