科研中的“新星”技术——MicroRNA荧光定量PCR

Micro RNA简介

微小RNA(microRNA，简称miRNA)是生物体内源长度约为20－23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。

是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。

第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括 人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百miRNA。到目前为止，已报道有几千种miRNA存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中，进化上高度保守。

Micro RNA产生机理

miRNA 是转录后长片段的 RNA 分子（pri-miRNA ）的一部分，首先在细胞核内被双链 RNA 特异的核酸酶Drosha处理成70-100 个核苷酸组成的发夹结构 RNA （pre-miRNA ）。

这一发夹结构 RNA 运输到细胞质，被另一个双链 RNA 特异的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 个核苷酸组成的成熟的 miRNA ，结合在与 RNA 介导的沉默复合物（RISC ）类似或者相同的复合物中，这个复合物参与了 RNA 干扰。

由 miRNA 和靶基因 mRNA 的碱基配对引导 RISC降解目的片段或是阻碍其翻译过程miRNA 和它的目的 mRNA 互补的碱基配对决定了这个过程的特异性。通过抑制翻译还是降解发挥作用是由 miRNA 和它的目的mRNA 之间的错配程度决定的，匹配程度高的目的mRNA 将被降解。

由于miRNA 可以对不完全互补的 mRNA 配对来抑制蛋白质的翻译过程，因而每个miRNA 可以有多个靶基因，而几个miRNA可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA 来经济地调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA 的组合来精细调控某个基因的表达。

对于基于miRNA 调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。如下图所示

Micro RNA的特征

已经被鉴定的miRNA据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21—25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。

最近3个研究小组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNA中，有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性（只有有1—2 个碱基的区别）。

Lau 和Bartel 实验室的同事更加认为：所有的miRNA可能在其他物种中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类，这些类似的基因被称为“直向同源物”）。

Bantam 最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的一个基因位点。已知几个包含增强子的转座子插入跨越这个位点的一段12.3kb区域会导致果蝇的眼和翅重复生长，而由转 座子介导的一段跨越该位点的23kb片断缺失则导致突变果蝇个体小于野生型果蝇。

Cohen和同事用一段3.85kb的片断导入21kb片断缺失的果蝇中 使其恢复原来的大小。但是奇怪的是表达这个3.85kb片断中的EST却没有同样的效果。

Cohen将这个片断和疟蚊Anopheles gambiae的同源序列进行比较，发现一段90bp的高度保守区，经过RNA folding program (mfold)发现这个保守序列可以形成发夹结构，使得这个区段很象是一个miRNA的前体。

这个结果经过Northern blot证实突变果蝇的幼体缺少一个21bp的bantam miRNA ，用这个90bp的mRNA前体经过一系列的“功能缺失”—“功能恢复”实验，证实 bantam miRNA在细胞增殖中的作用。

研究人员用计算机程序检索在hid mRNA的3’非编码区找到了bantam的3个潜在的结合位点（ hid是果蝇中一个诱导凋亡的基因），并证实 bantam miRNA抑制hid 的翻译而非转录。

miRNA 的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。