Trizol改良方法总结

1. 何首乌 富含多糖多酚等次生代谢物

① 200mg新鲜叶组织置于预冷研钵中，+聚乙烯吡咯烷酮粉(PVP)，液氮中研磨成粉

② 移入EP管中，+提取液（1ml Trizol +1%β-巯基乙醇+1% PVP），充分混匀，置于冰上

③ 每管+150μL无水乙醇+100μL 5mol/L的KAc（pH 4.8），混匀后缓缓+200μL氯仿/异戊醇（24:1），冰上静置10min

④ 4℃、12000r/min离心20min，上层水相，+等体积的Tris饱和酚/氯仿(25：24)，轻摇5min

⑤ 4℃、12000r/min离心10min，上清转到新EP管中，用氯仿/异戊醇（24:1）重复抽提至界面澄清

⑥ 上层液体+2/3体积的异丙醇+1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），-20℃沉淀3h

⑦ 4℃、12000r/min离心20min，沉淀经75%乙醇洗涤2次，晾干，20μL DEPC水溶解RNA

⑧ +180μL 0.3mol/L NaCl，混匀，RT离心20min，吸取上清，+2.5倍体积的无水乙醇和3mol/L NaAc（pH 5.2），-20℃放置30min

⑨ 4℃、12000r/min离心30min，沉淀经75%乙醇洗涤，晾干，50μL DEPC水溶解RNA

在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。

借助盐浓度来去除多糖的影响。首先在有裂解液和氯仿存在的条件下，RNase活性受到抑制，用低浓度的无水乙醇和Kac共同匀浆上清液中的多糖，通过离心 除去；并在沉淀RNA时两次加入高浓度的NaAc，多糖在此溶液中会发生溶解，最后在低浓度NaCl中多糖会析出，从而有效去除了绝大部分的多糖。

2. 香蕉叶片 富含多酚类物质、单宁、萜烯、色素、蛋白质、多糖等

① 100mg香蕉幼叶置于预冷研钵中，+10mgPVPP,液氮中研磨成粉，移入EP管中，+提取液（1ml Trizol +10μL 1%β-巯基乙醇），充分混匀，RT静置10min

② 4℃、12000r/min离心5 min，弃沉淀，200μL 5mol/L NaCl/1ml Trizol，混匀，+200μL氯仿/1ml Trizol，震荡混匀，RT静置15min

③ 4℃、12000r/min离心15min，取上层水相，+等体积的氯仿抽提

④ 4℃、12000r/min离心15min，取上层水相，+等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），混匀，RT静置5min

⑤ 4℃、12000r/min离心15min，取上清，+0.5ml异丙醇/1ml Trizol，混匀，RT静置5-10min

⑥ 4℃、12000r/min离心10min，弃上清，+1ml 75%乙醇/1ml Trizol，温和震荡离心管，悬浮沉淀

⑦ 4℃、8 000r/min离心5 min，弃上清，RT晾干，50μL DEPC水溶解RNA

⑧ 沉淀经75%乙醇洗涤2次，晾干，20μL DEPC水溶解RNA

⑨ +180μL 0.3mol/L NaCl，混匀，RT离心20min，吸取上清，+2.5倍体积的无水乙醇和3mol/L NaAc（pH 5.2），-20℃放置30min，取出后4℃、12000r/min离心30min

⑩ 沉淀经75%乙醇洗涤，晾干，50μL DEPC水溶解RNA

加入10%的PVPP与材料共研磨，并在Trizol提取液中加入1%β-巯基乙醇，可以完全排除酚类物质、色素等的干扰；并且增加了NaCl高盐溶液沉淀和氯仿抽提，有效地去除了RNA中的多糖和蛋白质。

3. 真菌（稻曲病菌） 富含RNase、多酚、多糖以及糖蛋白

① 2g香蕉幼叶置于预冷研钵中，液氮中研磨成粉，移入50ml离心管中，+20ml Trizol，用1ml移液器吹至液体澄清，且无细胞团块， RT静置10min

② +5mL氯仿/1ml Trizol，震荡混匀15s，RT静置3 min

③ 4℃、12000r/min离心15min，上层水相，+等体积的异丙醇，混匀，4℃静置10min

④ 4℃、12000r/min离心10min，弃上清，沉淀经20ml 75%乙醇洗涤2次，晾干，500μL DEPC水溶解RNA

改良：

a. 加入氯仿前添加5M NaCl高盐溶液4ml，摇匀

b. 在沉淀RNA之前加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，混匀，RT 5min，4℃、12000r/min离心15min

4. 麻风树胚乳 富含油脂、蛋白和多酚、多糖等次生物质 两次裂解法

RNA提取液Ⅰ：100 mmol/L Tris-HCl，400 mmol/L NaCl，1.5%SDS，2%β-巯基乙醇，pH 7.5(β-巯基乙醇在操作前现加入RNA提取液Ⅰ中至终浓度为2%)

RNA提取液Ⅱ：4 mmol/L 异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠溶液，0.5%(m/V)十二烷基肌氨酸

① 1-2颗(去除子叶)胚乳，液氮研磨成粉，移入EP管中，每管约加100mg，+600μL RNA提取液Ⅰ，涡旋振荡混匀，+200μL酸酚(pH 4.3)+200μL氯仿，震荡至彻底混匀，冰上放置5min

② 4℃、12000r/min离心10min，上清+500μL RNA提取液Ⅱ，震荡混匀，冰上放置5min

③ 4℃、12000r/min离心5 min，上清+1/2体积5mol/L NaCl，摇晃，+1/2体积氯仿，震荡混匀

④ 4℃、12000r/min离心10min，上清+等体积的异丙醇，温和混匀，RT放置10min

⑤ 4℃、12000r/min离心10min，弃上清

⑥ 沉淀+1ml 70%乙醇，4℃、12000r/min离心1min，弃上清，晾干，30-50μL DEPC水溶解RNA

加入SDS以提高裂解效率，β-巯基乙醇浓度提高到2%希望能有效抑制内源RNA酶活性，确保RNA不被降解

裂解提取液Ⅰ中，SDS通过使蛋白质变性破坏植物细胞膜结构，并能解开与核酸相连接的蛋白质，从而使核酸游离在裂解体系中；

此外，NaCl的加入增加了溶 液的渗透压，对RNA分子起到了很好的渗透保护作用，避免剧烈震荡对其的破坏；

β-巯基乙醇则起到了抑制RNA酶活性和酚类物质氧化的双重作用，为确保得 到高质量的RNA，我们将其浓度提高到2%。

而基于异硫氰酸胍法的提取液Ⅱ在提取液Ⅰ的基础上进一步强烈抑制RNase的活性，确保RNA不被降解，并有 效地解离核蛋白与核酸的复合物。

等体积的酸酚和氯仿

氯仿有效地溶解了材 料中质量较轻的油脂，使其分布于下层有机相中，便于之后吸取上清；酸酚的加入则提高了去除蛋白质的效率，减少了氯仿抽提次数，只需一次氯仿抽提，就能使有机相和水相的界面清亮，彻底去除蛋白，节省了试验时间，且降低了RNA的降解和损耗。另外，利用酸性酚还可以部分去除DNA，DNA残留低有利于得到纯度 更高的RNA样品。

保留了利用高浓度的NaCl去除样品中多糖的方法。

5. 柰树 富含多酚类物质、单宁、萜烯、色素、蛋白质、多糖等

改良Trizol法1

① 1.0g嫩芽置于预冷研钵中，液氮中研磨成细粉末，+10% PVPP(0.1g),继续研磨成粉末

② 移入大研钵中，预先装有 8ml Trizol提取液+ 80μL 1%β-巯基乙醇，研磨成匀浆，+无水乙醇至终浓度为20%，继续研磨混匀

③ 取1ml转入EP管中，+200μL氯仿，震荡混匀，RT静置5min

④ 4℃、12000r/min离心15min，取上清约600μL，+500μL冰冷的异丙醇，混匀，RT静置10min

⑤ 4℃、12000r/min离心10min，+70%乙醇洗两次

⑥ 4℃、12000r/min离心5 min，弃上清，RT晾干，30μL DEPC水溶解RNA

改良Trizol法2

① 改良Trizol法1中第一次用氯仿抽提的上清中，再加入等体积的氯仿抽提

② 4℃、12000r/min离心15min，取上清，+10mol/L LiCl至终浓度为3 mol/L，混匀，4℃过夜沉淀

③ 4℃、12000r/min离心15min，弃上清，+适量的RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀

④ +适量3mol/L NaAc（pH 5.2），混匀，+适量冰冷的无水乙醇，混匀，冰浴30min以上

⑤ 4℃、12000r/min离心15min，取上清，+1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），混匀，+3倍体积无水乙醇，混匀，-70℃过夜沉淀

⑥ 4℃、12000r/min离心20min，弃上清，+70%乙醇洗两次

⑦ 4℃、12000r/min离心5 min，弃上清，RT晾干，30μL DEPC水溶解RNA

改良Trizol法1的RNA样品呈乳白色、粘稠状；改良 Trizol法2的RNA样品呈乳白色、半透明，说明在研磨材料时，加入10%PVPP与材料共研磨，并在Trizol提取液中加入β-巯基乙醇，可以完 全排除酚类物质、色素等的干扰；但是改良Trizol法1的RNA样品呈粘稠状，这可能是存在多糖的干扰所致。

在研磨过程中加入PVPP，并在提取液中加入1%β-巯基乙醇，因为螯合剂PPVP分子中的CO-N=基能与多酚类物质（如原花色素类物质）芳香环上的羟 基结合形成稳定的复合物，使多酚类不能成为PPO的底物而被氧化，并且在以后的抽提步骤中被除去。

同时β-巯基乙醇分子中的巯基能打断PPO的二硫键使之 失活，从而防止了多酚类物质的氧化。因此，所提的RNA样品呈乳白色或白色，说明RNA样品中多酚类物质得到了有效的去除。

改良Trizol法2采用在匀浆液中加入终浓度为20%的乙醇沉淀多糖、在裂解液抽提的上相中加入终浓度为3mol/L LiCl沉淀RNA、在RNA的粗提液中加入适量的3mol/L NaAc（pH 5.2）和低浓度的无水乙醇沉淀多糖等方法相结合，可以有效地去除多糖的干扰，获得纯净、完整的RNA样品。

但在去除多糖的同时RNA也被裹携走，造成 RNA产量的减少。

改良Trizol法1单独采用在匀浆液中加入终浓度为20%的乙醇沉淀多糖的方法，不能将样品中的多糖去除干净，含有多糖的RNA沉淀难溶于水或溶解后产生粘稠状的溶液。