植物组织总RNA的制备：异硫氰酸胍—酚法

异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下：GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库，因此为大多数人采用。与氯化铯方法比较，虽然纯度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。 一、材料、试剂和 仪器 1 材料 植物组织（根或叶） 2 试剂 1） 异硫氰酸胍溶液：4mol/L 异硫氰酸胍（GIT），25mmol/L柠檬酸钠（pH 7.0）,0.5% 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）, 0.1M β－巯基乙醇 （用时再加，0.36mL/50mL体系） 2） 2mol/L NaAc （pH4.0）:用醋酸配，加少量水调pH。 3） 水饱和酚 （pH3.5） 4） 氯仿/异戊醇（CI）（24：1） 5） 异丙醇 ( －20℃存放) 6） DEPC－H2O （0.1%，V/V） 3 仪器 : 冰冻离心机，研钵 二、实验程序 1 大量提取 1） 取植物组织5g加入液氮充分研磨，转到一支预冷50mL的 离心管 中，顺序加入：15mL 异硫氰酸胍溶液，1.5mL 2M NaAc（pH4.0）,15mL水饱和酚和3mL氯仿/异戊醇。混匀后置冰上15min。 2） 4℃，15 000g 离心30min转上清于另一管中，加等体积异丙醇，混匀－20℃沉淀1hr.。 3） 4℃，15 000g 离心25min，弃去上清，加5mL 异硫氰酸胍溶液溶解沉淀后再加异丙醇—20℃沉 淀1hr。离心收集RNA沉淀，70％乙醇洗一次后晾干，加500μl DEPC处理的水溶RNA。取5μl电泳检测完整性，取5μl测紫外吸收值检测纯度及浓度。 2 小量提取 1） 取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状。加4－5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小 离心管 中，每管0.5mL。 2） 置于冰上，顺序加入：50μl 2mol/L NaAc , 混匀，0.5mL水饱和酚， 170μl CI，混匀。置冰上15min。 3） 各管平衡后，4℃,12 000g离心20-30min。转移上清到另一管中，加入等体积的异丙醇，混匀，－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。 4） 用70％乙醇洗一次，4℃，12 000g离心5min。吸去乙醇，空气中吹干RNA沉淀。用150μl 异硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。 5） 加等体积异丙醇－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。 6） 用70％乙醇洗两次后，吹干溶于适量的DEPC－H 2 O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于－80℃冰箱中存放。 7） 紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性 琼脂 糖凝胶电泳分析完整性。