RNAi总结

RNA干涉（RNAi）是指双链RNA分子使基因表达沉寂的现象，是在线虫中发现的，在 1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。过去几年中，科研工作者已明确转录后基因沉默现象普遍存在于动、植物中，在机体防御病毒入侵和转座子沉默效应中起着重要作用。 近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。 RNAi的分子机制     通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。     在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。     另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默. RNAi技术的应用 1． 功能基因组和遗传学应用 随着各种模式生物和人类基因组测序的完成，基因功能的研究远远落后于大量序列所提供的信息，研究和发现基因功能成为越来越紧迫的任务。长期以来，破坏基因结构或抑制基因表达是研究基因功能的重要方法，如常用的基因敲除技术( gene knock out) 。基因敲除技术要求对所研究的基因序列要有详细的认识比较费时费力。自RNAi 现象发现后，因其操作简单、特异性高、能迅速而方便地使某个基因失去功能等优点 获得了生物学家的青睐而首先被应用于功能基因组和反向遗传学的研究。RNAi 技术还具有一个优势 能同时封闭多个基因或基因家族 用于研究mRNA 差别剪接形成的异构体；甚至在基因组水平上构建针对基因组的RNAi 表达载体，用于研究基因之间的相互作用和进行基因功能的高通量筛查。相对于基因敲除技术可破坏基因的完整性，RNAi 技术仅仅使基因表达暂时降低，基因组的信息仍是完整的。利用RNAi 技术先封闭基因的表达，然后再激活，通过前后表型的变化，能方便地鉴定出基因的功能。 RNAi 技术为研究发育过程中基因的功能提供了一个手段，能很容易地制造出突变型个体。Amdam 等把dsRNA 注入囊胚前期的蜜蜂卵或初生蜜蜂腹内中，封闭vitellogenin 基因的表达(vitellogenin 基因在成体后才出现表型)，结果分别有15%和96%的个体出现突变型。15 天后，仍能检测到dsRNA 片段。在进行反向遗传学研究时，RNAi 技术也能用来寻找药物治疗靶点。Makimura 等利用RNAi 技术减少了丘脑下部AGRP(agouti-relatedpeptide) 50%的表达量，AGRP 使代谢率提高而不减少摄食量，从而减轻肥胖，为肥胖的治疗提供了一个靶点。为了明确Fas 信号通路在肝脏疾病中的作用，在小鼠模型中，利用RNAi 技术抑制Fas 的表达能明显降低自身免疫性肝炎引起的肝衰竭和纤维化，说明Fas 在肝脏疾病中所起的作用。 2. 基因治疗      反义核酸技术常用于基因治疗的研究。反义核酸技术没有放大作用，需要大量核酸，效果不持久。Bert rand 等研究表明，在培养的HeLa 细胞中分别转入反义寡核苷酸(AS-ODN) 和siRNA ，结果si-RNA 比AS-ODN 能更有效地抑制基因表达。在异种移植小鼠体内实验表明，siRNA 在体内能抑制基因表达，但AS-ODN 因其对核糖核酸酶抵抗性低，不能引起有效的基因表达抑制。RNAi 技术能使特异的基因封闭，阻止病原体的繁殖与传播；利用其特异性，抑制显性等位基因或突变基因的表达，甚至单核苷酸多态性，治疗肿瘤和遗传性疾病。RNAi 只抑制致病基因，而不影响正常等位基因的功能，具有较高的选择性和特异性，能减少非特异作用引起的副作用。目前的研究主要针对病毒性疾病和肿瘤性疾病。 3. 病毒性疾病      主要集中在对人类威胁性较大的肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒。已有研究表明利用RNAi 技术，在体外培养细胞中能抑制乙型和丙型肝炎病毒的复制。在体内实验中，把siRNA 注入丙型肝炎小鼠后，也能阻止病毒的复制，在慢性肝炎的治疗中显示出很大的潜力 。在急性肝衰竭的小鼠模型中，利用RNAi 来抑制caspase 8 的表达，阻止Fas 介导的凋亡，能明显延缓病情进展，提高生存率。Coburn 等针对HIV-1 的Tat 和Rev 基因设计并合成siRNA ，特异性地抑制Tat 和Rev 的表达。在培养的T 细胞和淋巴细胞中，siRNA 能抑制HIV-1病毒基因的表达和复制，从而能阻止病毒的传播。在流感病毒中，利用RNAi 技术也取得了较好的抑制病毒复制的效果。 4. 肿瘤性疾病 肿瘤是威胁人类生命的重大疾病之一，在肿瘤的综合治疗中，基因治疗日益受到重视。肿瘤是一种多基因疾病，针对单个基因的基因治疗一般不能取得好的效果。RNAi 技术可以针对信号通路的多个基因或者基因族的共有序列来同时抑制多个基因的表达，从而能更有效地抑制肿瘤生长。针对慢性粒细胞白血病的融合基因设计siRNA ，明显地抑制了体外培养细胞中融合基因的表达，促进白血病细胞的凋亡。Cioca 等利用粒细胞白血病细胞系研究了Raf-1 和bcl-2 基因在白血病中的作用，表明RNAi 能诱导细胞凋亡并能提高肿瘤细胞对化学治疗的敏感性。血管内皮生长因子(VEGF) 在肿瘤的发生发展中起重要作用，已成为肿瘤治疗的新靶点。Zhang 等利用DNA 表达载体来合成鼠VEGF 不同异构体siRNA ，特异性地封闭了大分子量VEGF 的表达，有效地抑制肿瘤细胞的生长。β-连环蛋白和APC 基因是Wnt 信号通路中的重要组分，突变后引起细胞异常增殖，在肿瘤的发生中起重要作用。Verma 等利用RNAi 技术使这两个基因表达降低，在细胞和裸鼠中都能抑制肿瘤细胞的增殖。以erbB1、端粒酶为靶点，利用RNAi技术抑制肿瘤的研究也取得了满意结果。 问题与展望 目前，RNAi 在非脊椎动物如线虫、果蝇、以及植物中的应用已经取得了一些重要的成果，但在哺乳动物中的应用还处于起步阶段。在哺乳动物细胞中，RNAi 并不能完全阻断基因的表达，特别是表达异常高的基因；其次，RNAi并不适应所有的基因，如dsRNA 对一些在神经细胞中发挥功能的基因抑制作用不明显；另外，运载体系一直是体内基因治疗的瓶颈，如何将双链RNA 高效特异的转入体内仍是一个难题。目前已能用腺病毒作为载体在体内实现RNAi ，但仍需要寻找更为安全有效的载体。RNAi现象存在的广泛性远远超过人们的预期，对此问题的深入研究将为进化的观点提供有力佐证。不可否认，与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，RNAi 技术具有明显的优点，它比反义RNA 技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失或降低突变。而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行，与T-DNA 技术造成的功能永久性缺失相比，它更受科学家偏爱。作者坚信随着RNAi的深入研究，一个崭新的RNA 时代即将到来。