mRNA差异显示技术[mRNA differetial display]

1.概 述 mRNA差异显示技术（mRNA differetial display）是一种快速有效的克隆差异性表达基因的方法。 方法建立：1992年 Liang P和Pardee首次应用DD技术对比人类乳腺癌细胞与正常细胞所表达的mRNA，以此来克隆癌细胞所特有的基因 目前已应用于个各领域： 农业、植物 动物 医学 • 胚胎发育 • 遗传病 • 药物 • 肿瘤 2.mRNA差异显示原理 是分离差异表达基因的一个重要方法。人类大约含有三万个不同的基因。在不同的单个细胞中只有10％的基因处于表达状态。 生物 体在不同的生理，病理状态下，基因的表达水平不同。 生命过程中选择性表达的基因主要有：发育与分化、体内平衡、对攻击的应答、细胞周期调节、老化和程序性细胞死亡等。 差异显示获得的只是某个基因的片段，而不是直接获得全长cDNA克隆。 3.基本程序 选择表型特性差异显著对象 展示mRNA的差异 基因差异 克隆与表型差异高度相关的新基因 4.技术 • 基本技术 逆转录（ RT ） 聚合酶链反应（PCR） 凝胶电泳 5.RT-PCR • 锚定引物 T12-MN，含有12个T可以结合于mRNA 3`端 poly（A）尾，M为A、C、G 3种碱基之一，N为A、T、C、G 4种碱基之一。 • 荧光锚定引物 ，引物5`端加入T7 RNA多聚酶启动子并带有荧光分子 ----------- AAAAAAAAAA –3` mRNA ------------XAAAAAAAAAAA–3` 1/3 mRNA MTTTTTTTTTTTT（12T） Prime ---------YXAAAAAAAAAAAAA –3` 1/12 mRNA NMTTTTTTTTTTTT（12T）Anchor Prime •荧光锚定引物： NMTTTTTTTTTTTT-T7 RNA多聚酶启动子-荧光分子 （Genomyx company） 因此共有12种锚定引物 • 同位素 标记锚定引物 •随机引物 （Arbitrary Prime） 可以随机地与cDNA不同位置多个位点结合，扩增出不同长度的cDNA片段混合物。 共20种随机引物，随机引物-M13 •随机和锚定引物的多种组合可以展示10000-15000种mRNA