用普通的提取法从组织中提取RNA

1.1 匀浆 1) 每个无菌的2 ml圆底离心管中加入1ml TRIZOL试剂，每个大鼠的腺垂体从-80°C取出后立即于预冷的TRIZOL试剂里用POLYTRON组织匀浆器（瑞士）进行匀浆。 【注：1. 匀浆液的量按每50-100 mg组织加1 ml TRIZOL，样品的体积不能超过匀浆液体积的10%。 2. TRIZOL试剂用前应于4°C保存，操作时应带手套和口罩。3. 匀浆器头用前需在3% H2O2（DEPCC水配）里浸泡，然后于0.1% DEPC水中空转2次，最后于TRIZOL试剂中空转2次，方可用于匀浆。4. 匀浆时间不宜太长，转速不宜过大，刚开始时由慢到快至中档处，然后减速，重复1-2次，未见有组织碎块即可．５．假如样品数多的话，可先将TRIZOL试剂一并加好，然后逐一加入样品匀浆。６.　特注：每加完一种试剂，都应及时盖上管盖，夹取管子或者打开管子时，尽可能不要碰到管的内缘。】。 2) 将匀浆样品置于15-30°C下静置5分钟，以使核酸蛋白复合物完全分离。假如所提取的组织中含有较多的蛋白、脂肪等，则应在匀浆结束后将匀浆液于4°C，12000 g，离心10分钟，取上清用于以下操作。 【注：假如此匀浆液暂时不用于实验，可于-80°C下保存至少1个月。】 1.2 RNA 提取 1) 加0.15 ml氯仿（每1 ml匀浆液加0.2 ml氯仿），盖好管盖，用手剧烈振荡15秒，于15-30°C下静置3分钟。 【注：假如样品数多的话，可先于一个无菌的离心管中倒入适量的氯仿，而勿需每次从大瓶子里吸取，这样可以减少污染，亦可加快速度】 2) 4°C，12000 g，离心10分钟。 3) 小心吸出上层无色溶液（约为匀浆液体积的60%）于另一个1.5 ml无RNAase的离心管中。 【注：此步非常需要注重的是，在吸取上清时，切勿切勿将中间和底层的有机相吸出，宁愿少吸一点上清。同时，最好是用小枪头吸，这样就可以保证不吸到中间相】 4) 加无RNAase的糖原10 μg（终浓度约为250 μg/ml，最多不能大于4 mg/ml），盖好管盖，充分振荡后，加入等体积的异丙醇（约400 μl），室温静置10分钟。 【注：1. 糖原应不含RNAase，其作用是能够携带液相RNA溶液，有助于其沉淀。2. 在4°C下静置轻易使其它不重要的物质沉淀下来，所以最好在室温下静置。3. 假如样品数多的话，可先于一个无菌的离心管中倒入适量的异丙醇，而勿需每次从大瓶子里吸取，这样可以减少污染，亦可加快速度。】 4) 4°C，12000 g，离心10分钟。 5) 小心倒去上清。加0.75 ml 75％乙醇清洗沉淀（0.1％DEPC水配制。缓慢用枪头打起沉淀，均匀吹打几次。每1 ml匀浆液加1 ml 75％乙醇），涡旋振荡，混匀。 【注：假如沉淀暂时不用于实验，可在加入0.75 ml 75％乙醇后，于4°C下至少可以保存1周，或于-20°C下至少可以保存1年。】 6) 4°C，7500 g，离心5分钟。 7) 重复步骤5)-6)。 8) 小心倒去上清，轻甩2下后，用移液器小心将离心管内残余的液体吸出，打开管盖，将沉淀于操净台上晾干（5分钟即可，完全晾干后反而会降低沉淀的溶解另外，亦可将装有沉淀的管子盖紧盖子后，放进一次性手套中，然后打开管盖，稍微包扎手套后，于50°C烘箱中放置3分钟即可）。 【注：假如来不急做完下面的工作，可将步骤8）所得到的沉淀于-80 °C保存。第二天直接从步骤 9)开始做，这样就可以增加RNA的保存，防止降解。