SMART8482; cDNA 技术问答

问：SMARTTM cDNA 技术的原理是什么？ 答： SMARTTM cDNA 合成技术利用总RNA 或者Poly A + RNA 作为模板，以一种改造的oligo(dT)寡苷酸作为引物，在MMLV 反转录酶催化作用下合成第一链。当反转录酶到达mRNA 的5"末端时，反转录酶的末端转移酶活性会在第一链 cDNA 的3"端加上3-5 个脱氧胞苷酸。SMART寡苷酸的3"端含有一段延长的鸟苷酸残基，与富集的胞苷酸退火形成延伸的模板。然后反转录酶转换模板，以SMART 寡苷酸作为模板继续延伸。这样合成得到的单链cDNA 在3"端有一段与SMART 寡苷酸互补的序列，在5"端有一段与oligo(dT)引物互补的序列。这些序列作为下一步进行长距离PCR 的引物合成位点。结果可以得到富集全长序列的双链cDNA。 问：SMART 试剂 盒系列产品之间有什么差别？ 答： SMART cDNA Library Construction Kit 是用来从少量RNA 样本中构建高质量的cDNA 文库。 试剂 盒中包括有SMART cDNA 合成和文库构建到? TriplEx2 或者Creator 供体载体pDNR-LIB所需的试剂。因为该试剂盒是特别针对文库构建来设计的，所以它与Clontech™ PCR-ｓｅｌｅｃｔ™cDNA 差减杂交试剂盒不能配合使用。 SMART PCR cDNA Synthesis Kit 可以用来与Clontech™ PCR-ｓｅｌｅｃｔ™ cDNA 差减技术一起使用。总RNA 不能直接用来做差减实验，但可以通过SMART PCR cDNA Synthesis Kit 来扩增出高质量的cDNA，从而可以用作杂交实验。同样，少量的Poly A+ RNA 也可以用SMART PCR cDNA Synthesis Kit 来扩增。SMART cDNA 也可以在你仅有有限的RNA 样本时从来做虚拟的Northern 杂交，用来代替标准的Northern 杂交。SMART PCR cDNA Synthesis Kit 含有SMARTⅡ寡苷酸和cDNA 合成引物，两段序列都具有用来做Clontech™ PCR-ｓｅｌｅｃｔ 差减所需的RsaⅠ位点。该试剂盒也可以从来构建SMART cDNA 文库于其它自选载体中。 SMART RACE cDNA Amplification Kit 结合了SMART cDNA 合成技术和RACE 的方法。该试剂盒优点在于可以构建全长cDNA,无需接头连接，灵敏度强，方法简单。 问：SMART技术可以用来做cDNA 末端快速扩增吗（RACE）? 答：可以。随着新的SMART RACE cDNA Amplification Kit 的进一步完善，SMART 技术的所有优点都可以用在RACE 方案中。 问：为什么在SMART cDNA Synthesis 过程中对PCR 循环数有一定限制？ 答：SMART cDNA 技术的独特点之一就是长距离PCR 扩增步骤。为了保持SMART cDNA 的基因代表性，进行尽量少的循环数量是很必要的。如果循环数过高，扩增超过指数增长阶段时，就会出现ssDNA 的积累，不适合进行cDNA 后期操作如克隆或者差减。此外，循环数越高，热稳定 聚合酶 出错的几率就越高，PCR 的保真度相应就会降低。因此，为了获得高质量的cDNA，稳定循环数在认可的参数之内是非常重要的。 问：SMARTTM文库的特点有哪些？ 答：SMART cDNA 文库富集了全长的cDNA。插入片段的平均大小是1.5-2 Kb。我们曾经从SMART 文库中克隆到的最大插入片段是大于6kb 的β-肌球蛋白cDNA。即使起初材料用的是总RNA，也几乎不会筛选到核糖体RNA。实验结果表明，来自于SMART cDNA 文库的50 个克隆分析表明没有核糖体RNA 克隆。以50 ng 总RNA 或者25 ng poly A + RNA 构建的SMART cDNA 文库的基因保真度，与用标准的Gubler and Hoffman 方法以5 ug poly A + RNA 构建的文库相似。 问：为什么SMARTTM PCR 扩增得到的cDNA 没有rRNA 序列？ 答：虽然在SMART 第一链cDNA 合成过程中rRNA 可以被反转录，但这些序列在接下来的PCR过程中不会被扩增。这是因为多数情况下，rRNA 序列是通过自身引导来反转录的，所以最终得到的cDNA 片段不具备5"和3"SMART 特异性序列，不能够进行指数PCR 扩增。 问：可以用作SMART PCR cDNA 扩增模板所需的RNA 的最少量是多少？ 答：虽然我们用SMART 技术可以从10ng 的总RNA 中构建文库，但我们推荐原始材料最少是50ng 总RNA 或者25ng poly A + RNA。从而保证SMART cDNA 群质量更高，基因代表性更强。 问：我可以改变SMARTTM寡苷酸序列吗？ 答：任何一种寡苷酸序列的改变都会影响cDNA 合成和扩增的效率。SMARTⅡ和SMART Ⅳ寡 苷酸的序列和设计都是受专利保护的。