Northern杂交分析

【操作】 1．RNA的提取见前。 2．变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入 DEPC H2O 12.4ml，加热熔化，冷却至60℃时加入5×甲醛凝胶电泳缓冲溶液4.0 、37%甲醛3.6ml、混匀、制胶。待胶凝固后，置于1×甲醛凝胶电泳缓冲溶液中预电泳5min。 3．样品制备 取总RNA4.5 ，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲溶液4.0 、37%甲醛3.6 、甲酰胺10、于65℃温浴15分钟,水浴冷却。加入上样缓冲液2 。 4.电泳 上样（约15～40 ），50V电泳（电泳约2小时）， 直至染色剂跑到凝胶边缘为止。用已知相对分子质量的RNA作标准参照物,如用18s和28srRNA或者9s兔β珠蛋白的mRNA,这些RNA的长度分别为6333,2366和710个核苷酸。 5.电泳结束后,切下相对分子质量标准参照物的凝胶条, 浸入含溴乙啶的染色液中浸泡30～40分钟,紫外灯下照相,测量每个RNA条带到加样孔的距离。以RNA片段大小的Ig值对RNA条带的迁移距离作图,以此计算杂交相对分子质量的大小。 6．将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜 （1）将凝胶用刀片切割,切掉未用掉的凝胶边缘区域,把含有变性RNA片断的凝胶转至玻璃平皿中。 （2）在一个大的玻璃皿中放置一个小玻璃皿或一叠玻璃作为平台,上面放一张Whatman3MM滤纸,倒人20×SSC缓冲溶液使液面略低于平台表面,当平台上滤纸湿透后,用玻棒赶出所有气泡。 （3）将NC膜切割成与凝胶大小一致的一块,用去离子水浸湿后转入20×SSC缓冲液浸泡半小时。注意不能用手直接接触NC膜。 （4）凝胶置于平台上湿润的3MM滤纸中央,滤纸和凝胶之间不能有气泡。 （5）将NC膜放在凝胶上,小心不要使其再移动,赶出气泡,做好记号。 （6）NC膜上覆盖另一层Whatman 3MM滤纸(用20×SSC缓冲溶液预先浸湿)，再次赶出气泡,依图所示加上纸巾、玻板、重物,使NC膜上的RNA发生毛细转移,转移需6～18小时，纸巾湿后应更换新的纸巾。 （7）取下NC膜,浸入6×SSC缓冲溶液(由20×SSC缓冲溶液稀释得到)中,5分钟后取出晾干,放在两层滤纸中间,于80℃真空炉中烘烤0.5～2小时。烘干的膜用塑料袋密封，4℃保存备用。 7．探针标记 (1) 取模板DNA25ng于0.5ml 离心管 中，95～100℃变性5min,冰浴5min。 (2) dNTPmix制备：取dGTP 1 、dATP1 、dTTP1 混匀。 （3）将下列反应成分混合，加入上述微量 离心管 中： dNTPmix ,BSA(10mg/ml) ,5×buffer , Klenow酶 ,αdCTP 加入适量ddH2O使反应总体积为50 ，轻轻混匀。室温下反应1h。 8.预杂交 将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42℃预杂交3h。 9．杂交 将变性的探针（95～100℃变性5min,冰浴5min）加入到预杂交液中，42℃杂交16h。 10．洗膜:倾去杂交液,2×SSC/0.1% SDS ,室湿洗15min,0.2×SSC/0.1% SDS ,55℃洗15min×2次。 11．压片 将膜用双蒸水漂洗片刻，用 滤纸 吸去膜上水分。用保鲜膜将 尼龙膜 包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-70℃放射自显影7天左右。