马铃薯总RNA的提取

1.RNA相关操作须注意之问题 2.TRizol Reagent抽提法 TRizol Reagent是Gibco公司产品。 1.取新鲜的材料10g，去除土或培养基，洗净，甩去明显的水分，初步剪碎，置于一研钵中(研钵应较大，陶瓷制品，确保能承受液氮)。 2.倒入适量的液氮，磨成粉末状。 3.在研钵中加入30ml TRizol，用研棒将之涂布于所有粉末之上。 4.室温静置，让其自然解冻，粉末逐渐变成黄土状、褐土状、泥浆状，此时再加入20ml TRizol，并用研棒研磨，直至变成酱红色的液体。(因取材的植物或植物部位的不同，颜色会有差异) 5.加4ml 氯仿，用手剧烈震荡15秒，静置2~3分钟。应当出现的现象是：上层水相无色，下层有机相呈深红色。注意：剧烈振荡相当重要，否则将出现完全相反的现象，即上层红色、下层无色；或者其他异常现象。 6.以12000g在2℃离心15min。 7.转移水相(上层)到新离心管中。加2/3体积的异丙醇以沉淀RNA。 8.以12000g在2℃离心15min。 9.去上清。 10.加75%酒精浸泡洗涤，静置10分钟。 11.倒去酒精，干燥RNA。注意不要过于干燥，否则影响后续的RNA溶解。 12.将RNA溶于适量无RNase的 水中，并用枪头来回吸几次。 13.在室温下，RNA浓溶液中也可能形成絮状大团沉淀。60℃水浴10分钟左右，此间每隔几分钟用手指轻弹管底助溶，有可能完全溶解，再回复至室温时则不会再析出沉淀。也有可能始终无法完全溶解，这大概是由于RNA溶液实在太浓。 14.用Parafilm膜将离心管盖封死，将离心管装于一专门的离心管盒(或其他适合的容器)中，保存于-70℃。避免反复冻融。 3.异硫氰酸胍小量抽提法 本方法基本参照《精编分子生物学实验指南》第125-126页，有简化，起始样品可低达50mg。 1. 试剂 2. 操作步骤 1).称取50mg的新鲜植物材料，坚硬部分可用剪刀初步剪碎。 2).往一微型玻璃匀浆器中加入0.5ml变性液(指工作液，下同)，再加入植物材料进行匀浆。注意：须保证植物细胞在变性液中被破碎。 3).至没有明显可见的细胞团块时，将匀浆转入一5ml 离心管 。 4).往匀浆器中再加入0.5ml变性液，洗刷粘附的勾浆，转入同一5ml 离心管 。 5).加入0.1ml的2M、pH4.0的醋酸钠缓冲液，混匀。 6).加入1ml水饱和酚，混匀。 7).加入0.4ml的24∶1氯仿/异戊醇，混匀。 8).0-4℃静置15分钟。 9).4℃、10000g离心20分钟，将上层水相移入一新的干净5ml离心管中，加入1ml异丙醇，-20℃放置30分钟以沉淀RNA。 10)4℃、10000g离心10分钟。 11) 4.RNA的简易电泳检测 由于RNA的易降解性，及RNA呈单链状态存在的现实，RNA的电泳检测需耍特殊的操作。以下是一种RNA电泳检测的简易方法，但并不适用于为转膜而进行的RNA电泳或其他在电泳后仍有后续操作的RNA电泳。 1.称取适量的电泳用琼脂糖，倒入一RNA专用制胶三角瓶(或其他适当容器)中，加入适量的电泳缓冲液。 2.加入溴化乙锭(EB)溶液至终浓度为0.5ug/ml。 3.加入DEPC至终浓度为0.01%。注意：EB和DEPC均为剧毒和致癌物质。 4.将三角瓶按高温高压灭菌的要求进行封口。 5.混匀。 6.前一天准备RNA专用的电泳缓冲液，容器内放置一小磁棒，加入DEPC至终浓度为0.01%，在磁力 搅拌器 上搅拌过夜。说明：因电泳缓冲液中的 Tris 成份能与DEPC发生化学反应，通常认为电泳 缓冲液 应以DEPC处理过的水配制而不能以DEPC直接处理。实验室中采用本方法似乎并未造成不良后果。 7.将凝胶预混物和电泳 缓冲液 高温高压灭菌。(以下操作应严格规范) 8.取一只未使用过的、无菌的一次性塑料手套平铺于公共的制胶平台上，将RNA专用的电泳胶模(整套电泳装置须确保无RNase)轻置其上，摆好梳子，保持水平。 9.将高温高压灭菌的凝胶置于微波炉中，以微火使之充分融化。按常规方式制胶。注意：慎防RNase污染。 10.用专用的、无RNase的加样板/纸、加样枪头和上样缓冲液加样。 11.在预处理的电泳缓冲液中电泳。因电泳过程中EB会向阴极移动，电压可适当偏高，电泳时间则适当减短。 12.紫外灯下观察、拍照。