产生RNA干扰RANi 的方法

4 产生RANi 的方法 产生RANi 的方法主要有体外合成和体内合成siRNA 法。将siRNA 导入细胞的方法又分为微量注射法、电穿孔法、浸泡法、工程菌喂养法、转基因法和病毒感染法等。 Harborth 等[14 ]设计体外合成21nt siRNA 的方法是：在基因库中寻找靶向基因的mRNA 序列，并从起始密码后的第75 位碱基开始寻找AA + N19 + UU 序列或AA + N19 序列，其中N19 为任意19nt 的mRNA核苷酸序列；然后设计选定序列中的G+ C 的比例为30 %--70 %；对确定的序列用Blast 搜寻EST基因库，确定所靶向的基因是唯一模簧杓?1 个反义RNA 序列，并用SiACE2RNAi 方法合成两条RNA 链，在其两链的3’末端最后2 个核苷酸设计合成dTdT序列，以减少细胞内降解。他们用体外合成的21 个核苷酸组成的siRNA 分别转染人和大鼠细胞株，作用于NumA 等16 个基因，使这些基因的表达均受到明显的抑制。 1998 年，Fire[1 ] 等用微量注射法将体外合成的dsRNA 注射到线虫体内,观察到dsRNA 可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞，并且RNAi 效应可以遗传至下一代,在子代仍抑制靶向基因的表达。并且给幼虫喂食可表达双链RNA 的细菌，或将幼虫浸泡在含有dsRNA 的溶液中，也能观察到特异的突变表型。 由于RNA 易于被RNA 酶分解，而且不论是生物合成还是化学合成dsRNA，成本均较高且费时，这在一定程度上限制了RNAi 技术的应用。在细胞内合成siRNA 诱导RNAi 的技术，大大削减了实验成本，增加了实验的可操作性。 Miyagishi[15 ]等建立了U6 启动子驱动的体内siR2NA 合成方法，成功地抑制了靶基因在哺乳动物细胞中的表达。他们设计构建了两个U6 启动子分别引导19nt 的siRNA 的正义链和反义链的合成，两段RNA 在细胞内退火连接成为双链RNA。Sui 等也构建了U6 启动子控制的siRNA 表达质粒，不同的是siRNA 模板为回文结构。在U6 启动子下游依次是siRNA 21nt 编码序列、6nt 的间隔序列、反向的siRNA21nt 编码序列及由5 个T 寡核苷酸尾组成的转录终止序列。这个质粒诱导合成的RNA 为发夹样双链结构。发夹样双链结构的RNA 比由正义链和反义链在细胞内退火后合成的dsRNA 似乎更能有效地抑制靶基因的表达。Brummelkamp[16 ]等构建了pSU2PER 质粒载体,应用了聚合酶ⅢH12RNA 基因启动子起始RNA 的合成。通过模板设计，使体内合成的siRNA 呈发夹样结构，并且能修饰3’端形成两个尿苷酸的突出结构，与化学合成的siRNA 结构相类似。为了使RNAi 技术成为可以控制的诱导基因沉默的方法，Miyagishi 等还建立了四环素调节的U6 启动子系统,通过控制U6 启动子就可以指令RNAi 在特定的时间发生作用。并且经克隆筛选,拥有细胞内siRNA 表达系统的细胞株可以长久保存并随时复苏使用。此外，一些在动物发育过程中起关键作用的基因，如果在DNA 水平采用基因敲除或突变进行可遗传的修饰，则可能会过早地导致基因沉默，产生致死表型，使研究无法继续进行。dsRNA 的表达受特异启动子的控制，可以有目的地在特定的时间启动RNAi 。控制RNAi 在发育阶段开始启动，可以研究发育早期的关键基因在发育后期的功能。 尽管质粒介导的RNAi 有上述众多优点， 但DNA 的转染多以瞬间表达为主，最长也不过几天。并且在某些种类的细胞,转染率很低，即使在同种细胞中，转染率也大不相同。为此，逆转录病毒和腺相关病毒[17，18 ]等也被用做载体。其原理是类似的，都是携带启动子和DNA 模板，在细胞内指导合成siRNA。所不同的是病毒载体介导的siRNA 合成更快速、一致和稳定，即使在某些非分化、原代培养的细胞中，转染率也能达到100 %。 Eric 等先将指导发夹样结构siRNA 合成的寡核苷酸序列克隆到pBS/ U6 载体，然后将U6 启动子和与靶基因互补的寡核苷酸序列酶解切割下来，用Klenow补平粘性末端后，再插入pMSCVpruo 中。应用这种逆转录病毒载体，他们成功地抑制了一种人类丝氨酸/ 苏氨酸激酶(NDR) 基因的表达。Changxian 等将H1-RNA 启动子序列和编码p53 基因的引物寡核苷酸序列克隆到无启动子序列的运输质粒pShuttle 上，然后将pShuttle253 与pAdEasy-1 重组，得到两个重组腺病毒DNA ，AdH1-53 和AdH1-empty。他们也成功地观察到了AdH1-53 诱导的p53 缺失表型。 噬菌体启动子启动下的转录技术也被应用到产生RNAi 中。Liang[8 ]等证实组成性细菌噬菌体λ启动子pL 的转录活性提高了2―3 倍。LaCount 等也用细菌噬菌体启动子T7 诱导了绿色荧光蛋白等基因表达沉默。 另外一项新进展是对5’UTR 和3’UTR 调节元件功能的研究。以往在设计dsRNA 的序列时一般均针对靶基因的外显子序列，含有内含子和启动子序列的dsRNA 一般不能产生 RNAi 。但最近发现RNAi 可以作用于5’非翻译区( 5’UTR) 或3’UTR[20 ，21] ,引起靶基因的沉默。Doench 等发现在培养的哺乳动物组织中，小干扰RNA 能与靶mRNA 的3’UTR 部分互补序列结合，抑制其表达，这与已证明的内源性编码miRNA 的功能相类似。Eckmann 等发现RNA 结合蛋白FBF 通过与调节元件fem-3 的3’UTR 结合，影响线虫精子的形成，从而决定卵的命运，并抑制决定性别的基因的表达。Yokota 等发现在HCV 基因组中，5’UTR 是一个高度保守区，这使之成为siRNA 理想的靶点。他们设计的siRNA 靶向结合HCV 基因组中的5’UTR ，抑制了病毒蛋白的合成。这些发现使科学家能够分析包含在5’UTR和3’UTR 内的调节元件的功能。如胚胎的发育过程完全依赖于mRNA 和蛋白质在正确的位置和时间内的表达或表达阻抑。用绿色荧光蛋白标记启动子或感兴趣基因的3’UTR ，也使实时跟踪基因表达和蛋白质形成的位置更加简易，不需要对组织有损伤的组织固定过程和特异性抗体的原位杂交。 14 Harborth J , Elbashir SM, Bechert K, et al. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs. J Cell Sci , 2001 , 114：4557～4565 15 Miyagishi M, Taira K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3’overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat Biotech , 2002 , 19：497～500 16 Brummelkamp TR , Bernards R , Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science , 2002 , 296：550～553 17 Brummelkamp TR , Bernards R , Agami R. Stable suppression of tumorigenicity by virus mediated RNA interference. Cancer Cell , 2002：243～247 18 Devroe E , Silver PA. Retrovirus-delivered siRNA. BMC Biotechnol , 2002 , 2：15 19 Liang ST, Bipatnath M, Xu YC , et al. Activities of Constitutive Promoters in Escherichia coli. Mol Biol , 1999 , 292：19～37 20 Doench JG, Petersen CP , Sharp PA. siRNAs can function as miRNAs. Genes Dev , 2003 , 17：438～442 21 Eckmann CR , Kraemer B , Wickens M, et al. GLD-3 , a bicaudal-C homolog that inhibits FBF to control germline sex determination in C. elegans. Dev Cell , 2002 , 3：697～710