油菜RNA的提取方法

1.取新鲜植物叶片0.1g(研磨样品前可用水或酒精清洗样品)于2mL离心管中，在液氮或-80℃下贮存。 2.研磨： 在样品研磨前，提取液[饱和酚︰(0.1mol·L-1LiCl、100mmol·L-1 Tris-HCl PH8.0、10mmol·L-1 EDTA、1%SDS)=1︰1]于80℃浴预热，加入前，提取混合液上下颠倒混匀。 3.提取： （1） 加入500µL80 提取液，30s涡流混匀； （2） 加入250µL氯仿︰异戊醇（24︰1），30s涡流混匀； （3） 置于冰上。 4.沉淀： （1） 离心：12000rpm，4℃，5min。 （2） 预处理：300µL的4M LiCl（相当提取液的一半）。 （3） 取样品水相与LiCl 按1︰1混合（如溶液混浊可再离心）。 （4） 沉淀：混合液于-20过夜。 （5） 收集：12000rpm，4℃，15min。 5.分离： （1） 弃上清，可剩余少量残留， （2） 加100µL的DEPC水，用吸管上下混匀溶解沉淀。 （3） 加入10µL的3 mol·L-1 NaAc(pH5.2)和200µL的95%乙醇。轻缓涡流几秒，RNA储于-20℃或-70℃过夜。 6.洗涤： （1） 12000rpm，4℃，15min， 弃上清。 （2） RNA沉淀用70%乙醇洗涤，12000rpm，4℃，5min后轻弃上清，旋转吸取液体。 （3） RNA于通风橱放置15min风干，并确保无水进入。 7.悬浮： 12µL的DEPC水溶解沉淀，储于-20℃或-70℃。 RNA提取完成后，利用琼脂糖凝胶检测RNA质量。 琼脂糖变性胶的制备：2.4g琼脂糖，150mL水，20mL的10×mops缓慢加热至沸（小心溢出）。冷却至50℃，加入30mL甲醛，总量200mL。 样品处理： (1)、2µL RNA悬浮液（0.5µg·µL-1）； (2)、3µL 变性缓冲液（10×mops︰甲醛：甲酰胺=1︰1.5︰5）； (3)、0.6µL LB（1mmol·L-1 EDTA pH8.0 ，50%甘油，0.25%溴酚蓝，0.25%混二甲苯）。 混合后置于65℃干浴5min后于冰上。 上样混合液按①︰②︰③＝1︰1.5︰0.3比例混合。 1µL的RNA上样混合液可在加热前/后加入，电解液为1×mops，并且高于稍胶面，电压小于500mA。