Northern Blot实验方法

[仪器、试剂、材料] （一）仪器 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。 （二）材料 总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜 （三）试剂 NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。 [方法与步骤] 1. 用具的准备： 180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。 电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。 处理DEPC水(2 L)备用。 2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染 用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。 3．制胶： 1． 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分) 2． 在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。 注意尽量避免产生气泡。 3． 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子 如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。 4．胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml　1＊MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。） 5．检查点样孔。 4. RNA样品的制备 在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。 5. 电泳： 1. 将RNA样品小心加到点样孔中。 2. 在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。 3. 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。 注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。 6. 转膜 1．用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。 2．用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。 3．连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。 4．盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。 5．将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。 6．将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。 7．打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。 8．转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。 9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。 10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间) 12．将膜在-20℃保存。 7. 探针的制备 1．在1.5ml离心管中配制以下反应液： 模板DNA(25 ng) 　　　　1ul Random Primer 2ul 灭菌水 11ul 总体积：14ul 2．95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。 3．在离心管中按下列顺序加入以下溶液： 10×Buffer 2.5ul dNTP Mixture 2.5ul 111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul Exo-free Klenow Fragment 1 ul 4．混匀后（25ul），37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。 5．65°C加热5min使酶失活。 　　　 8. 探针的纯化及比活性测定： 1．准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE（PH7.6）。 2．取1ml一次性注射器，去除内芯推�，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。 3．将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处 4．100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。 5．倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。 6．将标记的DNA样品加入25 ul STE，取出0.5ul点样于DE8　paper上，其余上样于层析柱上。 7．1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper. 8． 测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml）。　 9．预杂交： 1．将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。 2．加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2 膜面积加入10mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 hr。 10．探针变性： 1．用10 mM EDTA将探针稀释10倍。 2．90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min。 3．短暂离心，将溶液收集到管底。 11．杂交： 1．加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。 2．42℃杂交过夜（14~24hr）。 杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。 12．洗膜： 1．低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次。 2．高严紧性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，42℃ 摇动洗膜20min两次。 13．曝光： 1． 将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。 2． 检查膜上放射性强度，估计曝光时间 3． 将X光底片覆盖与膜上，曝光 4． 冲洗X光底片，扫描记录结果。 14．去除膜上的探针：将200ml　0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。 15．杂交结果 操作应该小心，但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse 酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡