利用Trizol法提取植物乳杆菌总RNA

一、实验原理

Trizol的主要成分是苯酚，苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的核酸物质得到释放。同时苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。

0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。利用Trizol试剂处理的样品加入氯仿后，经离心样品分成水样层、中间层和有机层。RNA存在于水样层中，收集水样层后可以通过异丙醇沉淀RNA。

二、实验试剂

Trizol试剂，DEPC，氯仿，异丙醇，DEPC处理水，75%的乙醇（DEPC水配制），植物乳杆菌05-19

三、实验仪器

恒温培养箱，常温离心机，低温离心机，移液器，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪

四、操作步骤

接植物乳杆菌于MRS液体培养基中，于37℃的培养箱中培养过夜备用。

取菌液2 ml，12000 rpm离心2分钟，弃上清，加入1 ml Trizol 试剂 ，用枪吹吸，悬浮菌体，室温放置十分钟。

加入200 ul氯仿，盖紧 离心管 ，用手剧烈震荡15秒，4 ℃12000 rpm离心十分钟。

取上清（大约500 ul），加入等体积异丙醇，-20 ℃放置十分钟，4 ℃ 12000 rpm离心十分钟。

弃去上清，加入1 ml 75%乙醇，混匀，4 ℃ 12000 rpm离心五分钟。

小心弃去上清液，室温干燥5-10 min，注意不要过分干燥，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶解到15 ul的DEPC处理水中。

进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将剩余RNA保存于-70 ℃。

实验注意事项

整个操作要带一次性口罩及手套，并尽可能低温下操作。

加入氯仿后，首先混合均匀，吸取上清时，注意不要吸入中间层及有机相。

使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染

配制溶液应使用无RNase 的水。