免疫PCR系列三-基本实验步骤

主要程序

（1） 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；

（2） 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；

（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；

（4） PCR扩增生物素化DNA部分。

实验步骤

（1）制备生物素化DNA

将噬粒 BLuescript skt,用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280bp DNa段，即为生物素化DNA。

（2）免疫PCR模式

1. 试剂

包被缓冲液：20mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3；

洗涤液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20；

稀释液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA （0.1mg/ml）。

2.操作

（1） 包被

用包被缓冲液稀释抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃过夜（约15h），用洗涤液洗板3次×5min。

（2） 封闭：

每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80min,洗板数次。

（3） 抗原抗体反应：

用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50μl，室温（22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未结合的抗体分子。

（4） 链亲合一蛋白A结合反应：

每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温（22℃）50min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10min,再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。

（5） PCR

实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明胶（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每种0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。