DD-RT-PCR定义是什么？
传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚
| 传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5'-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。 虽然mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）具有很多优点:1)速度快,较易操作;2)由于PCR扩增技术的应用,使得低丰度mRNA的鉴定成为可能,且灵敏度高;3)可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。但在实际操作中仍存在一些问题,主要表现在: 1)出现差别条带太多,假阳性率高达70%左右,重复性差,且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性; 2）在有差异的显示片段中难以知道哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因 3)得到的有差异的扩增条带短,一般在110～450bp之间； 4）以poly(A)为引物的PCR扩增只适合真核生物。 所以差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。 (责任编辑：大汉昆仑王) |
相关文章
