PCR/RT-PCR疑难问题解答

1. 问题： RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物。

可能原因：1 ） RNA 被降解 ( 如何确定 RNA 是否被讲解，详见前 “ 植物 RNA 的提取 ” 。 建议解决方法：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA 使用良好的无污染技术分离 RNA ；在将组织从动物体取出后立刻处理在 100 ％甲酰胺中储存 RNA ；如果使用胎盘 RNase 抑制剂，不要加热超过 45 ℃ 或 pH 超过 8.0 ，否则抑制剂或释放所有结合的 RNase 。而且，在 ≥0.8mM DTT 时加入 RNase 抑制剂，一定要存在 DTT 。2 ） RNA 中包含逆转录抑制剂建议解决方法：通过乙醇沉淀 RNA 除去抑制剂。用 70 ％（ v/v ）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗。可以加入糖元（ 0.25μg 到 0.4μg/μl ）以帮助小量样品 RNA 的恢复。逆转录抑制剂包括： SDS ， EDTA ，甘油，焦磷酸钠， spermidine ，甲酰胺和胍盐。将对照 RNA 同样品混合，同对照 RNA 反应比较产量以检验抑制剂。3 ）多糖同 RNA 共沉淀建议解决方法：使用氯化锂沉淀 RNA 以除去多糖。 自己的实验经验： 一般用乙酸钠就可以出去多糖，但是要用 70 ％乙醇洗 2-3 次除盐。4 ）用于合成 cDNA 第一链合成的引物没有很好退火建议解决方法：确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在 25 ℃ 保温 10 分钟。对于基因特异性引物（ GSP ），可以试一下其他 GSP ，或换用 oligo(dT) 或随机六聚体 . 确定 GSP 是反义序列。5 ）起始 RNA 量不够建议解决方法：增加 RNA 量。对于＜ 50ng 的 RNA 样品，可以在第一链 cDNA 合成中使用 0.1μg 到 0.5μg 乙酰 BSA 。6 ） RNA 模板二级结构太多建议解决方法：将 RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性 / 退火 . 提高逆转录反应温度，对 SuperScript Ⅱ 可以到 50 ℃ ，对 ThermoScript 可以到 65 ℃ 。注意：不要在＞ 60 ℃ 时使用 oligo(dT) 引物，选择一个在反应温度可以退火的 GSP 。对于＞ 1kb 的 RT-PCR 产物，保持反应温度 ≤65℃ 。注意：不要在高于 37 ℃ 时使用 M-MLV 。如果不需要全长 cDNA ，在第一链反应中使用随机引物。7 ）引物或模板对残余的 RNA 模板敏感建议解决方法：在 PCR 前用 RNaseH 处理。8 ）靶序列在分析的组织中不表达建议解决方法：尝试其他靶序列或组织9 ） PCR 没有起作用建议解决方法：对两步法 RT-PCR ，不要在 PCR 步骤中使用超过 1/5 的逆转录反应产物。2. 问题： PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物。可能原因：1 ） PCR 引物设计较差建议解决方法：避免在引物 3' 端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计 Tm 类似的引物。2 ） DNA 含有抑制剂建议解决方法：诸如 DMSO ， SDS 和甲酰胺之类的试剂会抑制 Taq DNA 聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀 DNA 。3 ）富含 GC 的模板建议解决方法：对于 GC 含量＞ 50 ％的模板，使用 PCRx Enhancer Solution 。4 ）模板浓度太低建议解决方法：使用 104 拷贝的靶序列，以在 25 到 30 个循环中获得信号。5 ）镁离子浓度太低建议解决方法：从 1mM 到 3mM ，间隔 0.5mM 进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量 PCR ，使用 3mM 到 5mM 的镁离子浓度。6 ）退火温度太高建议解决方法：使用表 4 的公式估算 Tm ，把退火温度设定为低于 Tm 5℃ 。因为这些公式只是估算 Tm 值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。7 ）引物浓度太低建议解决方法：最佳引物浓度介于 0.1μM 到 0.5μM 之间。为了精确确定引物浓度，在 260nm 测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。3. 问题： RT-PCR 特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。可能原因：1 ）物和模板非特异性退火建议解决方法：在第一链合成中使用 GSP ，而不是随机引物或 oligo(dT) 。试用允许高温 cDNA 合成的 GSP 。2 ） GSP 设计较差建议解决方法：遵循用于扩增引物设计的同样原则3 ） RNA 中沾染了基因组 DNA 建议解决方法：使用扩增级 DNase Ⅰ 处理 RNA 。使用没有逆转录的对照反应检测 DNA 污染。4. 问题： PCR 特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。可能原因：1 ）形成引物二聚体建议解决方法：设计在 3' 端没有互补序列的引物。2 ）引物和模板非特异性退火建议解决方法：以 2 ℃ 到 5 ℃ 间隔增加退火温度，减少退火时间。在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。使用 Platinum Taq DNA 进行自动热启动 PCR 。避免在引物 3' 端含有 2 到 3 个 dG 或 dC 。3 ）镁离子浓度太高建议解决方法：对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。4 ）因为扩增复杂模板导致引物错误起始建议解决方法：使用巢式 PCR 或递减 PCR 。5 ）沾染外源 DNA 建议解决方法：使用抗气雾剂的 tip 和 UDG 。6 ）因为二级结构导致引物结合位点无法接近建议解决方法：对于 GC 含量＞ 50 ％的模板，使用（ 1×-3× ） PCRx Enhancer Solution 。5. 问题： PCR 忠实性： PCR 在产物序列中引入了错误可能原因：1 ）聚合酶忠实性低建议解决方法：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如 Platinum Pfx DNA 聚合酶。2 ）循环数太多建议解决方法：降低循环数。3 ）四种 dNTP 的浓度不同建议解决方法：制备新的 dNTP 混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物