PCR扩增产物的RFLP分析
一、PCR产物用各种限制性核酸内切酶酶解 将PCR扩增产物分装，并用下列不同的限制性核酸内切酶酶切 DR1 ：Ava II，Pst I DR2 ： Fok I，
一、PCR产物用各种限制性核酸内切酶酶解 将PCR扩增产物分装，并用下列不同的限制性核酸内切酶酶切 DR1 ：Ava II，Pst I DR2 ： Fok I，Sau 96，HpH I DR3 、8、11、12、14： Ava II，Fok I，Kpn I，Hae II，Sau96，SfaN I，Sac II，Apa I （1）将8ul PCR扩增产物与1ul相应的酶切缓冲液混合。 （2）取1ul相应的核酸内切酶（含1~2单位）。 （3）用吸头混匀。 （4） 在适当的温度中酶切1~3小时，为了确定DNA是否完全酶解，可以在酶切缓冲液中加入具有相应酶切位点的对照DNA（已知长度、酶切位点的数目和位置、酶切后的条带）。 二、PCR扩增产物酶解后的聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR扩增产物经上述限制性核酸内切酶酶切后，一般用水平电泳装置和12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。 （1） 聚丙烯酰胺电泳凝胶的制备。 12%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制
| 凝胶成分 | 凝胶体积（ml） | ||||
| 125 | 100 | 80 | 40 | 25 | |
| 10×TBE | 12.5 | 10 | 8 | 4 | 2.5 |
| 双蒸水 | 38.15 | 30.52 | 24.4 | 12.2 | 7.63 |
| 30%丙烯酰胺 | 40.5 | 38.75 | 31 | 15.5 | 9.69 |
| 2%双丙烯酰胺 | 25 | 20 | 16 | 8 | 5 |
| 10%过硫酸铵（新鲜配制） | 0.875 | 0.7 | 0.56 | 0.28 | 0.175 |
| 四甲基乙二胺（TEMED） | 0.043 | 0.035 | 0.028 | 0.014 | 0.009 |
（2） 在酶解后的PCR扩增产物中加入8 ul 的加样缓冲液（0.05%丫啶橙，40%蔗糖），用加样器混匀。 （3） 将样本加入凝胶加样孔中，2000 V 电泳2.5~3小时。 （4） 用溴化乙锭或银染法显示DNA电泳条带。
相关文章
