RT-PCR在基因表达检测中的应用

RT-PCR检测基因表达的问题讨论 关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展， 在此主要讨论它在应用中的问题。理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷 贝）。1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数 量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低 靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。当已知量的 转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可 检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不 到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。 因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需 要。 将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。我们发现整个 反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓 冲液进行PCR扩增循环。当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合 成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA合成是否成功还没有进行过严格的研究。 反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重要。BRL和BOEHRINGERMANN HEIM的MULV反转录酶进行全面的研究，但没有理由认为来源可靠的反转录酶不能适用 于该方法。在研究中，我们仅使用了PERKINELMER/CETUS公司生产的TAQ聚合酶。 cDNA第一条链的合成可用不规则六聚体、寡聚(dT)或PCR下游引物来启动反应。 如果用寡聚(dT)，一般每次反应加0.1μL就够了。如果用下游寡核苷酸作为第一条链 的起始引物，10-50pmol最为理想。反转录反应以后，加入适量的上游和下游引物进 行PCR反应与用不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一种最后得到的扩 增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似乎更容易得到前后一致的结果，且靶序列 的合成量通常最多(E.S.K.)加入不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一 种最后得到的扩增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似站更容易得到事一致的结 果，且靶序列的合成量通常最多(E.S.K.未发表)。第一条链合成完毕，不必加碱或 RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活，同时也使RNA-DNA杂合子变性。 不必加碱或RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活，同时也使RNA-DNA杂 合子变性。残留的RNA模板似乎对PCR反应无干扰。 寻找使PCR反应产生良好扩增结果的最低浓度的寡核苷酸引物是十分重要的。我 们发现过量的引物通常会产生许多妨碍随后分析的额外扩增产物。浓度为5pmol的引 物可得到非常清晰及有效的扩增产物。当然，最好是找到你要扩增的每个序列的最佳 引物量。没有必要用全部的cDNA反应产物进行PCR扩增。可取等分量cDNA样品用几组 不同的引物作PCR分析;例如:一份cDNA反应物可用于研究几种不同类型的RNA。cDNA反 应物通常用PCR缓冲液衡释5倍。将cDNA的浓度隆低至0.2mM，此浓度更适于Taq聚合 酶。dNTP浓度不应超过0.2mM，因为较高浓度的dDTP使Taq聚合酶的错误掺入或突变率 增高。对于扩增来说，即使dNTP的浓度低到0.05mM也不会出现问题。 镁离子浓度对反应十分重要，因此应注意将镁的摩尔浓度保持恒定。有时核酸溶 于含1mMEDTA的缓冲液中，EDTA可歼螯合大多数镁离子。通常，PCR反应中游离镁离子 浓度应保持在2mM。 将PCRA循环次数减少，不可避免地产生许多非特异性的扩增产物。很容易将长度 不同的DNA的扩增。即使基因组序列得到扩增，当引物与大小不同的外显子结合时， 很容易将长度不同的MRNA与基因组的产物区别一来。如果不了解基因组的结构，选用 与5"编码基因间隔300-400bp的引物，脊椎动物的外显子很少大于300-400bp，因此很 容易从不同的外显子中导出引物。如果所研究的基因无内含子、或者研究完整原病毒 RNA转录，为了获得有关PCR的结果有必要用DNA酶彻底处理RNA。只要有很少量的基因 组DNA污染，用此方法分析就会出现假阳性结果。   实际应用举例 基因表达检测 用该方法先后扩增，检测了许多不同类型的细胞、组织和器官的mRNA。当然，仅 仅检测mRNA并没有新颖之处，它的新颖在于能对10-1000个细胞的RNA进行分析。所需 起始物质比通常的低很多，这使得研究者能设计并进行以前看是不可能进行的实验。 例如研究血细胞生成的研究人员经常用群体分析确定生长因子或环境对特殊细胞系发 育的影响。经常部到的一个问题是:群体细胞产生的何种生长/分化因子会影响其本身 的发育。现在可以确信，利用RNA/PCR技术能够对数百个群体的mRNA对任何与生长或 分化有关的因子进行分析。而用常规的杂交或抗体检测方法来分析它们是极其因难、 甚至是不可能的。RNA/PCR技术在研究转基因动物方面将非常有用。我们常常不仅要 知道在动物体内转移的基因是否表达，而且要知道是在哪些细胞．组织或器官中表 达。随着RNA/PCR检测灵敏度的提高，能够检测转基因动物的多个部位而不必为取样 而将它处死。我们还可以列举许多这样的例子，但我们留给读者一些有关检测方面的 设想。 用于诊断的RNA序列的扩增 在许多情况下，一个特异性的RNA分子可作为感染或遗传/癌疾病的诊断。在反转 录病毒疾病领域中，检测与具有侵染活性密切相关的反转录病毒RNA基因组或特异转 录子是否存在是非常重要的。现已对HIV-1病人，HTLV-1，2以及Moloney MulV的细胞 株进行了研究。也可以用RNA/PCR比较容易地检测出常见的感冒病毒即人鼻病毒。对 RNA和DNA病毒的RNA转录子的分析有利于对病毒的潜伏期，复制期等生活周期进行研 究。 在某些类型的癌细胞中有新的mRNA表达。如慢性骨髓性白血病(CML)．某些急性 淋巴白血病(ALL)和急性骨髓白血病(AML)，只在病人的白细胞中发现有嵌合的mRNA (BCR-ABL)。此嵌合mRNA是诊断此类疾病存在的良好依据。在许多肿瘤的治疗过程 中，肿瘤细胞对化学治疗具有抗性。DNA水平的扩增并不一定导致表达的增加，但大 量相应的mRNA的存在则使表达增加。DNA水平的扩增并不一定导致表达的增加，但大 量相应的cDNA的存在则使表达增加。用RNA/PCR方法来分析复合抗药性(MDR)10基因和 胸腺核苷酸合成酶(TS)基因，发现了这mRAN水平的增高.突变的RAS原癌基因的mRNA分 析(见参考文献25综术述)在癌症的诊断或预测方面具有诊断价值。mRNA分析比常规的 DNA基因组分析有优越之处。由于没有内含子序列干扰mRNA的扩增，因此可以仅用一 组引物就能够扩增H-，K-，和N-RAS三个mRNA序列(E.S.K，未发表)。这样便可以比较 容易地检测出第12、13和61密码的突变，这些突变被认为是发生癌的原因。 癌症诱因的检测 在下面将列举数个RNA/PCR扩增方法的主要应用。首先是对鼠鸟氨酸氨甲栈基转 移酶mRNA进行亚克隆来确定缺失点突变的位置。同样，该方法可用于检测哺乳动物细 胞mRNA转录后的剪接，研究与HLA疾病相关性因素，分析人HPRT突变，研究自身免疫 与T细胞受体序列之间的关系，分析人碱性磷酸脂酶的突变，研究土拨鼠肝炎病毒引 发的c-myc活性，确定刺桐丁蛋白4.1mRNA的剪接变异，等等。 　　根据已发表的序列合成扩增mRNA的引物，我们发现用RNA/PCR是获取cDNA的最简 便的方法。用在5"末端带有 限制性内切酶 位点的引物来扩增mRNA的一部分或全部编码 区域。扩增后，PCR产物经合适的酶切并与适于表达的载体连接或制备成探针。按此 方法可在一星期内完成从RNA样品到用于高效表达的修饰cDNA克隆.这比常规的合成/ 筛选cDNA库，亚克隆靶cDNA，为达到表达目的而对克隆进行诱变等过程要简单得多。 区别主要在于用于扩增和分离cDNA克隆的引物为简并引物。引物序列是根据 氨基酸 的 序列而定的，因此当只知道很少的蛋白质序列时，就有可能扩增特异的RNA分子。当 只知一个内部序列时，只用一个基因特异性寡 核苷酸 引物，也可用PCR从稀有mRNA中 分离出cDNA。扩增cDNA的分析因使用本书其它章切有关PCR产物的直接序列分析步骤 而变得简单。将噬菌体(T7)启动了作为PCR引物的一部分同样可用于序列分析，因为 PCR终产物中有大量的群体特异的产物。