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PCR技术

荧光定量 PCR

2024-05-13 PCR技术 加入收藏
简介定量 PCR 是指以一种标准作对照,通过对 PCR 终产物的分析或 PCR 过程的监测,对 PCR 起始模板量进行定量的技术。根据原理的不同,目前主要采用的

简介

定量 PCR 是指以一种标准作对照,通过对 PCR 终产物的分析或 PCR 过程的监测,对 PCR 起始模板量进行定量的技术。

根据原理的不同,目前主要采用的定量 PCR 方法包括极限稀释法、设立内参照物的定量 PCR、荧光定量 PCR (fluorescence quantity PCR,FQ-PCR)等。

其中荧光定量 PCR 是最新发展起来的一项定量 PCR 技术。

原理

荧光定量 PCR 基本原理是在 PCR 反应体系中加人荧光基团,在 PCR 反应过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化,当信号增强到某一阈值,此时的循环次数即循环阈值 Ct(cycle threshold,Ct)被记录下来。

该循环参数 Ct 和 PCR 体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系,利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的 Ct 值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟和作图,制成标准曲线。

最后根据待测样品的 Ct 值,通过标准曲线就可以准确地确定起始模板的数量。根据所用的探针的不同,可以分为两种,一种是 Taq-man 荧光探针,另外一种是荧光染料。

SYBR 是不对称菁类荧光素,它非特异嵌合于 DNA 双螺旋结构中的小沟内,发出荧光信号,而不掺入链中的Sybr染料分子不会发出任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

此方法避免了设计、标记荧光探针和使用价格昂贵、复杂的试剂,适用于任何 PCR 扩增体系。

材料与仪器

器材:

①荧光定量 PCR 仪

②紫外分光光度计

③微量移液器(20 μl)

④0.2 ml Ep管(灭菌)

试剂:

①材料: 标准 DNA 模板、样品 DNA

②SYBR I 荧光染料

③上游引物及下游引物

④dNTP 混合液

⑤Taq DNA 聚合酶

⑥10 x PCR 反应缓冲液

⑦灭菌水

步骤

荧光定量 PCR 的基本过程可分为如下几步:

(一)试剂配制

(1)上游引物及下游引物 浓度 20 μmol/L。

(2)dNTP 混合液 将 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP 钠盐各 100 mg 合并,加去离子水 2 ml 溶解,用 0.1 mol/L NaOH 调节 pH 值至 7.0~7.5,使其浓度为 5 mmol/L,分装后 -20 ℃ 保存。

现也有商品化的混合液(各 2 mmol/L)供应。

(3)Taq DNA 聚合酶 5 U/μl,使用时其在 50 μl 反应体积终浓度为 1~2.5 U。

(4)PCR 反应缓冲液(10x)500 mmol/L KCI,100 mmol/L Tris-HC1(pH 8.4),15 mmol/L MgCl2

(二)定量标准品的制备

(1)在一个 Ep 管中加入标准 DNA 模板 1 μg、特异上游引物及下游引物各 2 μl、10 x PCR 反应缓冲液 5 μl、Taq DNA 聚合酶 5 U,灭菌水补足 50 μl,混匀。

(2)在 PCR 仪上进行扩增反应:95 ℃ 变性 30 s,55 ℃ 退火 30 s,72 ℃ 延伸 1 min,30 个循环。

(3)将 PCR 产物纯化、测序验证,测定 OD 值,根据分子质量,换算出每毫升拷贝数,贮存备用。

(三)制作定量标准曲线

(1)将定量标准品分别稀释 102、104、106、108、1010 倍,分别取稀释标准品 5 μl,按上面的方法加入 PCR 反应试剂,另外再加入 Sybr I 荧光染料 2 μl,总体积 50 μl。

(2)分别按上述 PCR 反应条件在荧光定量 PCR 仪上进行 PCR 反应,由计算机自动生成定量标准曲线。

(四)样品测定

(1)在 Ep 管中加入样品 DNA 5 μl,上游引物及下游引物各 2 μl,10 x PCR 反应缓冲液 5 μl,Taq DNA 聚合酶 5 μl ,SYBR I荧光染料 2 μl,灭菌水补足 50 μl,混匀。

按上述 PCR 反应条件在荧光定量 PCR 仪上进行扩增反应。

(2)根据样品测定的结果,结合定量标准曲线,由计算机自计算样品中的拷贝数。

注意事项

(1)严格优化 PCR 扩增反应的实验试剂与条件

①模板的制备注意避免 DNA 的降解,并尽量纯化 DNA 使其不含任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能与 DNA 结合的蛋白质。

②为保证 PCR 特异性扩增,引物的设计应符合以下原则:引物长度以 15~30 个碱基为宜,上下游引物的长度差别不能大于 3个。

(G+C)含量应在 40%~60%,4 种碱基要在引物中分配均匀;引物自身不应存在互补序列,不能有大于 3 bp 的反向重复序列,否则引物自身会折叠形成发夹结构。

上下游引物之间不应有多于 4 个的互补或同源碱基,尤应避免 3’端的互补重叠,以防形成引物二聚体。

引物的 3’端不能进行任何修饰,也不能有形成任何二级结构的可能,3’端碱基尽量不选用T。

引物的 5’端可以进行修饰,加上一些有用而又不与靶 DNA 互补的序列计算出来的 2 个引物的解链温度相差不能大于 5 ℃。

③引物浓度应先通过预实验确定最适浓度,浓度范围一般为 0.2~1.0 μmol/L。

④循环参数 PCR 中控制温度是关系到实验成败的重要环节。退火的温度及时间依赖于引物的长度、浓度以及碱基组成中(G+C)含量,一般来说,退火温度为引物的解链温度减去 5 ℃。

延伸温度要根据 Taq DNA 聚合酶的最适作用温度而定,通常在70~75 ℃,延伸时间则依据扩增片段的长度而定。

⑤PCR 缓冲液 Mg2+的浓度对 PCR 产物的特异性及产量有明显影响,各种单核苷酸浓度为 200 μmol/L,Mg2+ 为 1.5 mmol/L 时较合适。

另外,不同厂家的 Taq DNA 聚合酶的缓冲液成分也不相同,使用时应注意是否配套。

⑥为避免非特异性扩增,可以采用 Taq DNA 聚合酶的「热启动法」。

(2)设置对照实验:为确保结果的可肯定性,应设置阳性对照及阴性对照或空白对照。

(3)防止 PCR 污染。

(4)对于同一套参考标准品与多次独立制备的样品进行重复实验,所获得的实验结果进行统计学显著性分析,使实验方法标准化,并具有可重复性。


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