定量PCR技术简介

一、 定量PCR的基本原理： 在PCR实验条件下（Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板），经变性→退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数；Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n个热循环中其Ev是一致的话，经n个循环后的扩增产物的分子数（Y）和反应物中原始分子数（X）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n。 1. 终点法定量原理： 在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数) 2. 实时检测法定量原理： 在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)3. 扩增效率（Ev）的影响因素： 以上所述的定量原理均假定反应体系中扩增效率是不变，但是，实际上，Ev在不同的扩增管之间和同一扩增管的不同循环次数之间是不同，如何控制及解决Ev的变异以及标本制备的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的发展方向，那么，Ev的影响因素有： a. 引物和靶序列的结合能力（G+C%及突变），扩增产物的长度，G+C含量。 b. 模板的含量、DNA聚合酶、反应液成分变化。 c. 不同临床标本间DNA聚合酶抑制物的存在情况。 d. 循环扩增仪上不同位置的差异。 二、 定量PCR方法的分类： 目前对标本的靶DNA或基因的相对或绝对含量是不同样品的PCR产量检测而推算出来，根据标本中是否加入内标物，将分成以下两种： （一） 外标法定量PCR： 一个已知含量的标准品（通常用质粒）经一系列的稀释后与待检标本一起进行扩增，制作PCR扩增产物和靶核酸含量的标准曲线，根据待检标本的扩增产物量即可推算出靶核酸的绝对含量；上述已提及不同标本间的扩增效率（Ev）的差异，对样本间PCR产量作比较会产生很不准确的结果；以外还应考虑“平台效应”对结果的影响，因为“平台期”PCR产物量并不受初时模板量的影响；导致结果的准确性和重复性差，因此采用外标法应该注意： a、 注意标准化操作，优化最佳实验条件，减少标本间Ev的差异导致对结果的影响。 b、 标准品的稀释因存在随机分布而导致结果的不准确。 c、 注意“平台效应”对实验结果的影响。特别是后面提及的终点法检测PCR产物的方法中。 d、 由PCR方法很灵敏，特别RT-PCR方法，没有内标存在的情况下，标本的污染而对实验结果产生很大的影响。 e、 标本处理对结果的影响。 （二） 内标法定量PCR： 由于上述提及的外标法存在不同标本间的Ev差异和标本的提取（特别是RT-PCR）的微小变化都将导致扩增产物的巨大差异。为了清除此种影响，国内外都推重采用内标法。内标法是用PCR技术进行准确定量的基础和今后的发展方向，根据采用内标品的不同，又分为非竞争内标定量PCR（quantitative PCR with noncompetitive intenal standands）和竞争定量PCR（competitive quantitative PCR）