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PCR技术

成功的RT-PCR的几个要素

2024-11-11 PCR技术 加入收藏
成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信

成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA,都可以检测到扩增结果(图2)。另外,分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化,从而使信息的检出和定量产生偏差。但是我个人认为不会,除非mRNA抽提 试剂 盒或者相关方法对内参以及目的基因的mRNA有选择性,否则样本间抽提效率的差别完全可以用内参来校正啊。然而,当分析稀有mRNA时,poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。 为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。 另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。 为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇,室温放置3-5分钟,10,000×g离心5分钟。 也可以使用Qiagen等公司的特殊RNA保护 试剂 。Merck的inhibitor是世界第一,大家可以选择性使用。 在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中,在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A,B,C对RNA的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了这些抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase。 2、使用无RNaseH活性(RNaseH-)的逆转录酶 逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV,在本身的聚合酶活性之外,都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链,并降解RNA:DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。而且降低逆转录酶的RNaseH活性会加大RT酶的热稳定性。通常有点突变和缺失突变两种,优先选择缺失突变的。此外AMV酶热稳定性更高,推荐。 3、提高逆转录保温温度 较高的温度有助于RNA二级结构的打开,增加了反应的产量。 对于多数RNA模板,在没有缓冲液或盐的条件下,将RNA和引物(三种引物都可以的)在65℃保温,然后迅速置于冰上冷却,可以消除大多数二级结构,从而使引物可以结合。这个方法可以试一试。但是这个步骤之后反应条件如何设置我没有经验,是加入酶和其他反应组分后变性再RT还是直接开始RT程序?我认为后者才对。 此外是否可以考虑加入RNA inhibitor更为安全一些。 还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度,并加入预热的2×的反应混合物提高特异性(cDNA热启动合成)。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用 PCR仪 可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。 然而某些模板仍然会存在二级结构,即使热变性后也是如此。上面简单的处理方法倒是不花钱,呵呵。对这些困难模板的扩增可以使用一些特殊的逆转录酶,逆转录反应可以置于较高温度下进行,增加特异性,尤其是当使用基因特异性引物(GSP)进行cDNA合成时。如果使用GSP,确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。 此外注意不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。此外 RNA在高于65℃时开始水解,对于≤1kb的RNA第一链合成温度可以为70℃,对于>1kb的RNA则需要<65℃。 4、促进逆转录的添加剂 包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中,可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构,最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度,可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中,那甘油在扩增反应中的浓度为0.4%,这不足以抑制PCR。 5、RNaseH处理 在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板,据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合,在这种情况下,RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时,RNaseH处理是必需的,比如低拷贝的tuberous scherosisⅡRNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应,RNaseH处理是可选的,因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA:DNA复合物中的RNA水解掉。 通常是不推荐此方法的。

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