聚合酶链反应在HIV感染研究中的应用

八十年代以来由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的艾滋病(AIDS)因其严重的危害性而受到人们高度重视，力争早期诊断和寻求有效治疗是防止其广泛传播的关键所在.聚合酶链反应(PCR)具有敏感、特异和快速的特点，是检测病毒、评价病情进展和探讨发病机理的有效工具. 一、HIV的基因结构 　　HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分子，其单链RNA分子由9749个核苷酸组成，有3组共9个基因。第一组为逆转录病毒共同的基因，即gag、pol和env基因，及侧翼的长末端重复顺序(LTR)等.其中前三者为病毒的结构基因，编码病毒蛋白，而基因组两端的LTRs，不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性.第二组为调节基因表达的基因，即tat、rev和nef基因，可以增强或抑制其它基因的表达.第三组为特有基因，负调控病毒的感染性，成熟或释放，即vif、vpu和vpr.HIV有十分高的遗传变异率，它是一个多态性病毒，从不同的AIDS患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异，事实上，独立分离到的HIV-1和2彼此都不相同，这是由于病毒传播过程中突变，缺失或插入引起的，高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段，gag和pol基因较少变异，因此，只有选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因加以扩增，才能有效地检测所有HIV的变异性.目前已知HIV有两个型，HIV-1是从欧洲和美洲分离毒株的总称，亚洲地区的流行株也基本上为HIV-1，HIV-2是从西非的妓女分离的毒株. 二、PCR在鉴定HIV感染中的意义 　　HIV常可引起潜伏感染，但仍具有传染性，整合的病毒基因组在每个细胞中仅以很低的DNA拷贝数存在，因此，需要建立一个敏感而又特异的HIV检测方法.传统的检测途经很多，包括外周血抗原测定，病毒分离和逆转录酶法等，但均费时费力，稳定性也差.核酸杂交虽有一定的特异性，敏感性却较低，利用原位杂交发现AIDS患者仅有10 4 ～10 5 之一的细胞有含有HIV-1DNA，实际上远不至此.聚合酶链反应被称为无细胞的分子克隆技术(cell-free molecular cloning)，自1987年即被用于AIDS的研究中.Ou利用针对HIV-1LTR，gag和env基因的三对引物对HIV血清学和病毒分离均阳性与血清学阳性，但病毒分离阴性的男性同性恋者进行外周血单个核细胞(PBMC)前病毒DNA序列的测定，发现前者的阳性率为100%，后者也可达60%，对照组则均为阴性，因此提出PCR可以作为病毒分离的替代方法.Imagawa将PCR与其他几种传统方法进行比较，结果在分离出HIV-1前，具有血清阳转的4例男性中3例可用PCR检测出外周血淋巴细胞中gag基因的存在，这种阳性反应可发生在血清阳转前38～42个月，而在得出PCR阳性结果前，无一例分离出病毒，因而认为，对仍从事高危活动(如吸毒、同性恋等)的血清阳性个体，PCR能有效地发现HIV感染者的存在.此外，临床上AIDS患者常出现神经症状，而在许多血清学阳性个体的脑脊液(CSF)中却未分离出HIV-1，因而难以确定病毒的侵袭范围.利用PCR技术已经证实了CSF中存在着前病毒DNA和游离病毒RNA序列，而且RNA量似乎比DNA更为丰富.至于CSF中病毒序列的存在是否与神经系统的损害有关，目前仍存在不同意见，但至少无症状感染者CSF中HIV-1的存在对阐明与HIV-1相关的神经损害具有重要意义. 　　研究表明，HIV感染的女性所生的婴儿中有30～59%可在宫内、分娩过程或产后哺乳期感染该病毒，但由于婴儿体内存在来自母体的抗体且可持续15个月左右，同时又缺乏检测IgM型抗体的手段等原因，使得传统方法在鉴定新生儿是否感染方面受到限制，及时地对新生儿作出诊断，对于其获得早期治疗具有积极的意义.PCR技术所需标本量少，对新生儿、婴儿的诊断尤为适用.Roger用PCR对血清阳性母亲所生的23例儿童从新生儿开始进行外周血前病毒DNA的跟踪监测，结果表明，在后来发展为AIDS的7例儿童中，有5例在新生儿期即存在病毒序列，而血P24抗原却检测不到;具有AIDS非特异表现者，也有4/14在新生儿期呈阳性PCR反应;由这些母亲所生的健康儿童和阴性对照组则均为阴性，说明本方法的特异性和灵敏性极高.Soeiro进一步用PCR法证实了宫内感染的存在，采集了23例AIDS或血清阳性母亲的流产儿组织，进行PCR扩增，并作原位分子杂交比较，结果有7例用PCR检测到HIV-1DNA，而原位杂交只有1/8流产儿组织呈阳性反应.

由于HIV具有高度的变异性，使得AIDS的治疗显得颇为棘手，现已发现体外病毒分离株对AZT易感性降低.Richman利用一对寡核苷酸引物对接受AZT治疗者的外周血进行PCR扩增，得到的535bp的片段中含有与AZT耐药性有关的4个逆转录酶基因突变位点，而且突变数目与耐药程度成比例，因此，PCR能有效地监测毒株的耐药性.利用env基因的高度变异性，对该基因特异性扩增后进行病毒分型，对于监测毒株的变异及分子流行病学的研究具有十分积极的意义;对分娩健康婴儿的AIDS女患者HIV基因的扩增及分析，也有利于探讨母婴垂直传播的条件及毒株的特点，从而研制出有效的疫苗. 　　由此，我们可以看出，PCR技术在鉴定HIV感染方面具有重要的意义，它可检出抗体出现前的感染者，筛选新个体，确定病毒类型和耐药毒株，区分儿童感染的时间，并可作为AIDS的预后指征.