单个细胞的PCR分析

单个二倍体细胞

在分析单精子以前，Li等人对个体二倍体细胞内的β珠蛋白基因进行过研究。两 个组织培养细胞株用于这些实验。其中一个纯合是镰刀型细胞密码子6（βS）发生突 变，另一个纯合子则来源于正常的βB等位基因。扩增含有密码子6的β珠蛋白片段的 引物，及能够区别这两个特异的等位基因的寡核苷酸探针（ASO）已经报道过。βA纯 事细胞和βB纯合细胞和βS纯合细胞在同一组织培养瓶中共同培养数天。将用相差显 微镜观察到的混合培养的单个细胞转入溥塑料胡管内。分别将单个细胞转入含裂解液 的PCR管中，保温后，加入PCR缓冲液，缓中有四种dDNP．Taq DNA聚合酶和扩增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分钟变性靶DNA，然后根据已发表方法的改进方案进行 50全循环的扩增。通过打点杂交，等量的扩增产物打点于尼龙膜后，扩增产物分别与 βA和βS的探针杂交。所分析的37个细胞中，84％细胞只与βA和βS探针杂交，杂交 强弱各不相同；19个与βA探针．12个与βS探针杂交。12个以水作空白对照的反应管 中瓜呈阴性，它表明忽略不记DNA的污染。没有与两种探针都杂交的样品，它暗示转 入到反应管中的单个细胞，而且组织培养基中存在的从βA或βS细胞中裂解出来的 DNA并未吸附在单个细胞上。

　　单个细胞的PCR扩增产生的β珠蛋白基因的数量通过与已知携带蛋白基因的质粒 DNA样品在杂交模上的杂交信号的强度进行比较确定。据估计PCR反应开始时，一个二 倍体细胞珠蛋白DNA量（3.0X10 -24 摩尔）在5－500毫微微摩尔之间，每个PCR循环以 平均效率65％计算，经50个循环后它的DNA相当于平均扩增了7.6×10 10 倍。考虑到扩 增的程度之大，因此排除任何可能的污染对于单个细胞的分析十分关键。

单精子的分析

　　Li等人随后对位于染色体19编码LDL受体(LDLr)的基因的杂合体单精子的基因型 进行分析。根据已知的DNA序列，他们用PCR和ASO分析检测LDLr的RFLP。PCR的引物和 探针以前已有报道。单个精子的分离与二倍体细胞的分离方法一样，精液经蔗糖梯度 离心得到纯化的精子，精子于－20℃可保藏8个月。显微镜下将单个精子吸入毛细塑 料针管内，然后转入试管内以作裂解。裂解的方法与发表的方法冲液(50mM KCL， 10mM Tris.HCL，pH8.3，2.5mM MgCl 2 ，0.1mg/ml明胶），0.05mg/ml蛋白酶K，20mM DTT和1.7μM SDS。37℃保温1小时，加入PCR反应物以前，样品加热到85℃。PCR扩 增。对80个精子LDLr基因型已作过分析。55%的雄配子显示出杂交信号。22个携带 LDLr等位基因，21个携带LDLr2基因。仅一个与两种探针杂交都呈阳性。16支对照反 应管中加入所有反应 试剂 但没有精子，结果无杂交信号出现。两个扩增的等位基因的 分布遵循Mendel独立分离定理，它表明PCR反应以单个减数分裂产物为起始，无污染 的二倍体DNA存在。