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PCR技术

PNA 介导的钳制 PCR

PCR
2024-05-13 PCR技术 加入收藏
简介PNA 介导的钳制 PCR,英文名是 peptide nucleic acids PCR clamping。PNA(肽核酸) 是一种以中性酰胺键为骨架并兼有

简介

PNA 介导的钳制 PCR,英文名是 peptide nucleic acids PCR clamping。PNA(肽核酸) 是一种以中性酰胺键为骨架并兼有多肽和核酸性质的独特化合物。PNA 与互补的 DNA 或 RNA 序列杂交具有极强的特异性和热稳定性;PNA 不易被蛋白酶和核酸酶降解;PNA/DNA 杂交结合强度与盐浓度无关。

原理

PNA 介导的钳制 PCR 的基本原理:

检测基因中是否存在突变时,采用两条竞争性引物,一条是与野生型互补的 PNA 引物,一条是与突变型互补的 DNA 引物。当基因未发生突变时,PNA 引物与靶序列结合的能力高于 DNA 引物,而在 PNA 结合靶序列后,由于 PNA 不能通过 DNA 聚合酶而延伸,从而不能引起片段的扩增;当基因中存在突变时,DNA 引物与靶序列的结合强度高于 PNA 引物,产生扩增片段。PNA 引物也可以位于突变引物的下游或者是扩增片段的 内部,当 PNA 与靶位点结合后,也能阻止扩增反应的进行。

用途

PNA 介导的钳制 PCR 可用于检测突变,还应用于微生物多样性分析、转基因植物的监测及食品来源的探究等方面。该方法还可与其它方法联合使用,如与 PCR-SSCP、RFLP 及实时 PCR 等。

材料与仪器

器材:PCR 扩增仪

试剂:

① dNTP

② Taq DNA 聚合酶

③ 10× PCR 缓冲液

④ 无菌 PCR 管

⑤ 待检测的基因 (野生型及突变型)

⑥ DNA 引物 (包括正、反向引物)

⑦ PNA 引物

⑧ 去离子水或蒸馏水

步骤

PNA 介导的钳制 PCR 的基本过程可分为如下几步:

A. 将 PCR 管放置在一个架子上并排列标记好。

B. PCR 管中加入如下试剂:

C. 向 PCR 管中分别加入 1 ul 去离子水、野生型 DNA、突变型 DNA 以及野生型和突变型 DNA。

D. 混匀后,将 PCR 管放到 PCR 仪中,按下列程序开始循环:

E. 样品贮存于 4 ℃,或直接进行琼脂糖凝胶电泳分析。

注意事项

要使突变位点位于 PNA 引物的中间,PNA 引物的 Tm 为 65~75 C。设计多条 DNA 引物,引物的 5' 端要比 PNA 引物长 5~10 nt,使突变位点也位于引物的中央。采用 4 步扩增法,与普通的 3 步 PCR 反应相比,增加了 PNA 退火过程。PNA 的退火温度比 PNA/DNA 的 Tm 值低 5 °C。

测试不同的 PNA 浓度(0.1~10 umol/L)对于 PCR 反应的抑制程度。如果没有抑制效应,增加 PNA 的浓度,并降低 PNA 退火温度;如果抑制过度,没有 PCR 产物出现,则增加 DNA 引物的浓度,并降低 PNA 引物的浓度。PCR clamping 技术中重要的一点,就是不需要在每个循环中都彻底抑制所有靶位点的扩增。



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