PCR在病毒学中的应用

　甲型肝炎病毒是甲型肝炎的病原体.甲型肝炎呈世界性分布，其传染源是甲型肝炎病人及病毒携带者.HAV主要随粪便排出，但在血液、唾液、胆汁和十二指肠液也可查出.本病的传播主要是通过粪--口途径，如经日常生活接触传播，经污染饮水或食物而传播.其中无黄疸型肝炎患者容易漏诊或误诊，是重要的传染源，具有重要的流行病学意义.除病人外，还有亚临床感染，其无症状或有较轻微病状，转氨酶轻度升高，血清中可查出抗HAVIgM，粪便中可检出HAAg或HAV颗粒，亦是不可忽视的较重要的传染源. 　　甲型肝炎病毒经粪--口途径进入消化道后，首先在肠上皮和局部淋巴结细胞内繁殖，然后进入血液形成病毒血症，经血液循环到达其靶器官--肝细胞中定居繁殖，引起肝功能异常，出现发热、巩膜黄染、小便浓茶色、恶心、厌油腻、血清转氨酶升高等症状或体征. 　　甲型肝炎病毒为单股正链RNA病毒.直径约27nm、呈20面立体对称的球形颗粒，1982年国际病毒分类委员会曾将其分类为微小RNA病毒科肠病毒72型，随着对HAV的不断深入研究，发现其与肠病毒属的成员有很多不同之处，国际病毒分类委员会于1991年将HAV重新分类为小RNA病科肝病毒属，也有人建义命名为肝RNA病毒属.它即强调了HAV的嗜肝性，又突出了HAV的基因是RNA，同时又与HBV嗜肝DNA病毒属相对应.

一、甲型肝炎病毒的分子生物学 (一)HAV基因组 　　HAV全基因约含7500个核苷酸，各HAV株间序列中的核苷酸数略有不同.其中HAV野毒株HM-175基因组全长7478个核苷酸，分5"端非编码区和3"非编码区及居于中间的开放阅读框架区(编码区)三部分.5"端非编码区是HAV基因组中最保守的部分.其株间核苷酸序列一致性达96～99%.此区共有734个核苷酸.5"非编码区有2个聚嘧啶环，邻近5"端的第一个聚嘧啶环是独特的，不为其它RNA病毒所共有;第二个聚嘧啶环位于编码区的起点附近，与其它小RNA病毒同源.5"非编码区含有识别和连接宿主核蛋白体的重要遗传信息.开放阅读框架区编码2227个氨基酸的多聚蛋白.被一个天门冬酰胺密码子分开的2个蛋氨酸密码中的任何一个可能是翻译的起点.其编码多聚蛋白的基因从5"端开始可分为三个区，即P1区、P2区和P3区.P1区编码4个衣壳蛋白1A～1D，通常称为VP1、VP2、VP3和VP4.VP1最大可能和VP3一起构成抗原的免疫决定簇.P2区是转录及基因调控区.P3区编码非结构蛋白3A、3B、3C和3D，HAV蛋白3B可共价结合于HAVRNA5"端，与启动RNA的生物合成或与病毒的装配有关;HAV3D蛋白为依赖RNA的RNA多聚酶.代表了多聚酶的活性部位. 　　P1区:位于HAVRNA735～3107位核苷酸区域，为HAV衣壳蛋白编码区，可编码791个氨基酸.从5"端开始按其次序分别称为VP4(735～803)，VP2(804～1469)，VP3(1470～2207)，VP1(2208～3107). (二)HAVRNA的基因型 　　HAV只有一个血清型.但通过对HAV核酸序列分析，发现HAV有若干个基因型.1991年Robertson用HAVP1区VP1基因的不同片段作为分型标准，将22株来自世界不同地区的HAV分为三个基因型(Ⅰ～Ⅲ型)，1992年他又对全球29个国家的152株HAV，以VP1和P2区的不同序列作基因分型，根据基因分型标准，把核苷酸序列差异<15%的划为同一基因型.从而将HAV分为7个基因型(Ⅰ～Ⅶ型)，人类HAV有四个型，(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ)，非人灵长类亦有四个型(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ).其中的Ⅲ型为人类和非人灵长类所共有的混合型.人类HAV各基因型间，核苷酸异源性为15～20%.同一基因型的不同亚型之间，异源性低于7.5%，同一亚型的地方流行株核苷酸异源性低于3%.但变异的核苷酸大多发生在密码子的第三位上，不会改变氨基酸的组成，故各株间的抗原性差异不大. (三)基因变异 　　HAV的变异主要有自然变异，生物学变异和细胞培养变异及减毒变异.自然变异主要发生在P1区，其中VP1和VP3区变异较多见.HAV氨基酸的变异常发生在VP3的65、70和VP1的102、105、174、178和221位，而VP3的70位几乎在所有的HAV株中都存在变异.