PCR技术

RT-PCR引物的选择

2024-11-12 PCR技术加入收藏

随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA.适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。Oligo dT适用

随机引物

适用于长的或具有发卡结构的RNA.适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。

Oligo dT

适用于具有PolyA尾巴的RNA.（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

基因特异性引物

与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时性引物代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性引物连用。

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

原因	建议
引物	引物特异性差	重新设计引物，改变引物的位置和长度，增强其特异性或使用巢式PCR
引物浓度过高	适当减少引物浓度
Mg2+浓度	Mg2+浓度过高	适当降低Mg2+浓度，从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
耐热聚合酶	酶量过多	以0.5U为间隔适当减少酶量
退火温度	退火温度过低	适当提高退火温度或采用二阶段温度法
PCR循环次数	PCR循环次数过多	减少PCR循环次数