Real-time PCR

从细胞或组织中提取出来的 RNA，经过反转录成 cDNA 后，以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，进而检测目的基因的表达，能检测极为微量的 RNA 样品。

检测目的基因的表达

RT-96 孔板或 RT-8 连管、引物、反转录试剂、RT-检测试剂、双蒸水、离心机、RT-PCR 仪

1.基因组 DNA 的去除。

一般现在的反转录试剂都配备了 DNA 酶，用以去除 RNA 样品中混有的基因组 DNA，避免后续检测过程中基因组 DNA 可能对检测的影响。通常取 0.5-1μg RNA 样品，按照试剂中的反应条件，去除基因组 DNA。

2. RNA 反转录。

按照试剂盒的说明，在上述体系中加入相应的酶等成分，进行反转录。

3.转录产物的稀释。

PCR 检测程序中，产物都是以指数增长的，反转录得到的体系较少，有的时候同一个样品需要检测多个基因的表达情况，为了加样的准确性，一般会将转录产物进行稀释，通常情况下将转录产物稀释 5-10 倍。

4.PCR 上样检测。

为了减少误差，会先将同种成分配制成一个体系，再分装至 8 连管或 96 孔板中，如：检测试剂（包含酶、探针、buffer、离子等）、前后引物、水等可以配制在一起，最后再往孔中加入对应的反转录产物。加样完成后，上机检测。

5.下机，分析数据。

1.一般条件下，提 RNA 所用的枪头、器皿等用的都是商家处理好的成品，比较少的情况需要实验者额外的再去用 DEPC 处理这些耗材。并且有多家公司推出了 RNA 酶清除试剂，号称能有效的清除周围环境的 RNA 酶，能有效的减少 RNA 的降解。但是清洗 RNA 沉淀用的酒精还需要实验者用 DEPC 处理后的水进行配制。

2.考虑到市面上酶的扩增效率，以及实验操作的简便性，RT-PCR 的检测引物长度一般控制在 100bp-200bp 的范围。

3.为了避免 RT 检测引物和基因组 DNA 的非特异性结合，推荐使用含基因组 DNA 去除成分的反转录试剂。

4.RNA 的污染无处不在，建议提取 RNA 的过程在超净台中进行。

5.为了防止非特异性扩增，一般设置阴性对照，即用双蒸水代替 cDNA 模板。

6.RT-PCR 过程中，加样的准确性对实验结果的影响较大，为了尽可能避免加样导致的误差，对于相同组分，一般混合好体系之后再分装，最后再加 DNA。

7.加样的时候，孔的侧壁可能有液滴，所以上机前一般会将孔板或 8 连管离心，也能更充分的混合溶液。

一、样品间的差异大

1.首先看是不是该基因的含量低，一般 30 循环以上含量就较低了，会导致孔之间的差异大，如果一定需要检测，可以尝试减小反转录产物的稀释倍数；

2.加样不均匀，极容易发生在加 DNA 模板的时候，枪头中的样品打的不干净；

3.相同的成分可以配制好体系混匀之后，再加样。

二、每一对新引物，第一次用的时候都建议做一个阴性对照，检查该引物的特异性。