PCR实验操作程序

一、实验步骤

1. 在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：

2.  用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。每加一管换一次Tip。

3.  振荡每只管，然后短暂离心。

4.  将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环： 

5.  将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。电泳条件：60-80V，15-20分钟。

6.  紫外分析仪检查电泳结果。

二、讨论

1. 假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。