Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > PCR技术

PCR技术

大引物 PCR 构建定点突变序列

PCR
2024-05-14 PCR技术 加入收藏
简介大引物 PCR 构建定点突变序列只需要一个诱变引物,是目前以 PCR 为基础的诱变方法中最简单和经济的。原理大引物 PCR 构建定点突变序列的基本原理是通过

简介

大引物 PCR 构建定点突变序列只需要一个诱变引物,是目前以 PCR 为基础的诱变方法中最简单和经济的。

原理

大引物 PCR 构建定点突变序列的基本原理是通过两个侧引物,和一个带有预设突变的内部诱变引物,获得定点突变产物。该方法包括两轮 PCR,需两个侧引物,一个带有预设突变的内部诱变引物。侧引物能够与克隆基因或临近载体序列互补。

理论上,诱变引物的扩增方向可以朝向任意的侧引物。然而,实际上诱变引物总是朝向两个侧引物较近的一个,这样能把大引物的长度保持最短。在大引物 PCR 中,第一 轮 PCR 是在诱变引物和较近的侧引物间进行,以野生型 DNA 为模板。

第一轮反应的产物(双链大引物)被纯化,并同另一侧引物一起进行第二轮 PCR,所得产物为包含突变的双链 DNA,大小为两个外侧引物间的距离。图解示意。

材料与仪器

器材:PCR 扩增仪、电泳仪、水平电泳槽;

试剂:

① 10 × PCR 缓冲液:内含 15 mmol/L MgCl2,500 mmol/L KCl,100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3,25 °C);

② 10 × dNTP 混合物:内含 2 mmol/L dGTP,2 mmol/L dATP,2 mmol/L dCTP 和 2 mmol/L dTTP;

③ 3 种寡核苷酸引物;

④ 模板 DNA;

⑤ 热稳定 DNA 聚合酶;

⑥ 凝胶:含 0.5 g/mL 溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶;

耗材:PCR 管、移液枪头。

步骤

大引物 PCR 构建定点突变序列的基本过程可分为如下几步:

① 在一支 PCR 反应管中混合以下试剂,组成第一轮 PCR 反应:10X PCR 缓冲液 10 μl,模板 DNA 约 10 pg,10X dNTP 混合物 10 μl,热稳定 DNA 聚合酶 1~2U,10 umol/L 突变引物 1 μl,水加至 100 μl,10/umol/L 对应侧引物 1 μl。 

② PCR 扩增:94 °C 预变性 4 min;循环 25 次,每次 94 ℃ 变性 1 min,50 °C 退火 1 min,72 °C 延伸 1 min,最后一次延伸 10 min(可根据引物序列和扩增片段长度调节退火温度和延伸时间)。

③ 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 反应产物。

④ 纯化 PCR 产物(选做)。

⑤ 在第二支 PCR 反应管中混合以下试剂,组成第二轮 PCR 反应: 10X PCR 缓冲液 10 μl,模板 DNA 约 10 pg,10X dNTP 混合物 10 μl,热稳定 DNA 聚合酶 1~2U,第一轮 PCR 产物 10 pmol,水加至 100 μl,10 μmol/L 另一侧引物 1 μl。

⑥ PCR 扩增:94 °C 预变性 4 min;循环 25 次,每次 94 °C 变性 1 min,50 °C 退火 1 min,72 °C 延伸 1 min,最后一次延伸 10 min(可根据引物序列和扩增片段长度调节退火温度和延伸时间)。

⑦ 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 反应产物。

⑧ PCR 产物克隆,筛选突变体,分析扩增的 DNA 片段的全序列。



文章底部广告位

文章评论

加载中~