PCR常见问题分析及解决方案

PCR技术的发明

1983 Kary Mullis 发明

1985 开始有文章发表

1993 获诺贝尔奖

广泛用于分子生物学研究领域

变性--退火--延伸三个步骤

1、模板DNA的变性：93℃-95℃左右

2、模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5 ℃

3、引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性

PCR标准反应体系

DNA模板 p引物 p反应缓冲液 pMg 2＋ pdNTP p耐热聚合酶 pddH2O

反应体系对PCR扩增的影响

1、DNA模板:

纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 浓度适当

2、引物

设计 长度适当、避免二级结构和二聚体 合成质量 浓度 50uL体系引物加量为10-20 pmol

3、反应Buffer

pH、盐离子、稳定剂、增强剂 提供缓冲环境

4、Mg 2＋浓度

过高非特异性严重 过低无扩增产物

5、dNTP Mixture

浓度适当，避免反复冻融

6、ddH2O

pH值适当，避免污染