PCR技术系列九：PCR扩增产物的电泳分析

凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法。琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物。根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连 接等。

一、凝胶浓度

凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定。

表：琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围

二、电泳缓冲液

核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE)。TBE 与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使 DNA沉淀。TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解。

10XTBE缓冲液的配制

Tris硷，108克

EDTA，9.3克

硼酸，55克

H2O至，1000ul

(其PH应为8.0～8.2)

临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释。

三、核酸电泳的指示剂与染色剂

1、指示剂

核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色。溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。

指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用有①增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。

2、染色剂

核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其 次是银染色。

溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对 之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。

银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。 也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收。

四、电泳

1、电泳装置:

电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等。

2、电泳方法:

(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净。放在水平桌面上，并架好梳子。

(2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段， 可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳。

3、配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅 或微波炉内加热熔化。冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固。

4、向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。如样品孔内有 气泡，应设法除去。

5、在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。

6、接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负)。电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算)。

7、根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般200～400bp的PCR产物50V电压， 电泳20～40min即可。

(3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小。