AluPCR:用重复序列引物

AluPCR:用重复序列引物

扩增来源复杂的人DNA 引言 　

聚合酶链反应PCR使不同来源的特异核酸片段的分离及分析发生了革命，但应用PCR分 离，分析特定DNA 区域需要了解靶区域的边侧序列，这使扩增局限于已知DNA 序列。我们研究了从复杂的人和其他种DNA 混合物中扩增未知DNA 序列。

特别是，我们应用PCR 分离出了在啮齿类细胞 背景中含有人染色体片段的体细胞 杂合体中的人DNA 。使存留 在杂合子中的人特异区域序列得到分离和鉴定，避免了克隆 DNA 库和用人特异重复序 列探针他离人序列克隆 。

我们所用的方法，即AluPCR，也已被证明可从克隆 中快速分 离插入的人类DNA ，这将PCR的应用扩大到克隆 于Lambda和酵母人工染色体(YAC)载体 上的基因组DNA ，PCR在大基因组区域上的应用为分析人基因提供了另一个工具。 　

AluPCR方法特点在于利用人DNA 中普遍存在的Alu重复序列，这种300bp序列的拷贝约 900.000个，分布于整个人基因组。虽然Alu重复序列各拷贝间有很大差别，但已确定 出了一个相同序列，且重复子中一些区域是极为保守的。

我们认为，可设计合适的能 识别这些保守区的PCR引物，进行有效的内-Alu扩增，从复杂源中分离人DNA 。为了只 扩增体细胞 杂合子中人DNA 而不同时扩增啮齿类Alu等位子，我们需要鉴定人特异引 物。 从杂合细胞 株中扩增人特异DNA 　

我们合成了大量引物，测试了它们扩增人、体细胞 杂合子及啮齿类DNA s的能力。所示为用TC-65和#278两个引物增的结果，#278识别啮齿类DNA 扩增啮齿类序列，而 TC-65引物对人DNA 物异，从X-3000-11.1杂合细胞 株(含Xq24-qter，是人类特有的中 扩增出数目不同的带。

值得注意的是，TC-65引物在310bp的灵长类特异的插入区中， 此插入区在人Alu序列的第二个重复子上而#278引物则定位于哺乳类Alu-等位子中高 度保守的重复部分，关于所涉及的反应条件及引物的详细描述，已送出版。

下面概述一下我们的发现。序列的扩增量似乎依赖于寡聚核苷酸引物量及在总目的 DNA 中人类目的DNA 所占的量。最初的有效引物TC-65是含有17个碱基的Alu序列和含一 个NotI酶切点的13碱基5'端外延序列，设计NotI酶切位点是为了克隆 扩增的产物。

单独使用TC-65只在方向相反间距5-6kb的Alu序列间进行扩增。但也并不扩增所有这样 的Alu序列时，而是偏向于某些特异的Alu重复子。杂合细胞 株X-300011.1表现出这一 现象，该株中，TC-65引物扩增出的带数在50-100间，该杂合子中含约40Mb人 DNA ，认为Alu重复对特异地适合用这种引物扩增。

极为有趣的是我们发现用TC-65引物从X-300011.1细胞 株(所有其他杂合株含有人hprt 位点)中扩增的一个序列(3.5kb带)可与hprtmRNA的cDNA 探针杂交。在肯定一个真正的 人特异序列被扩增后，该序列也为研究在这个扩增产物中包含的Alu重复序列提供了 机会。

为定位hprt基因中的重复子，我们用TC-65引物扩增了整个编码区的6个噬菌体 克隆 DNA 。其中两个克隆 显示出预期的3.5kb带，并能与hprtmRNA的cDNA 探针杂交。

因为这些克隆 互相重叠，并只含外显子7、8、9，我们估计此序列的Alu重复子引动合成 位置间距3.5kb，方向相反且在基因中跨越上述三个外显子中的一个或更多个。检查 来自这一区域的序列(与W.AnsorgeEMBL/Heidelberg，Edwards合作)已使我们鉴定出 所含的Alu序列.

该Alu重复子跨越外显子9，其中一个复制子位于外显子8与外显子9 间的内含子上，另一个在编码区的下游。包含在扩增产物中的下游Alu重复子能与引 物中17个碱基的Alu序列完美互补，但与引物的5'端尾部没有特异的同源性。

外显子8 和9间的Alu重复子与引物中17个碱基Alu序列有一个碱基错配，但这可由引物中紧邻 Alu区的尾部中的另外两个配对所弥补，保证了一排中19分之18的同源碱基，该序列 信息会使我们了解TC-65引物扩增的选择性质。

更为重要的是鉴定这对可扩增Alu重复 子，可使我们在用其他引物扩增序列的反应中确定重要参数。 　

已发现其他互补于相同区域Alu重复子的引物也能特异地扩增杂合细胞 中的人DNA ， TC-65引物中17个碱基的互补序列也有用，从杂合细胞 人基因区扩增出一组独立片 段。没有尾部的引物有特别的用处，可从给定的DNA 源扩增出更多的序列。

例如，用 这些引物扩增X-30011.1细胞 株，呈现出几百条带的一片，而含较少量人序列(1-2Mb) 的杂合子只显示出可数的带数(10-20条)。

这些引物使AluPCR技术扩展到几个不同的 领域，包括用杂合子中扩增的产物作杂交探针鉴别从总人DNA 库特异基因组区域中克 隆的DNA ，及对从脉冲中电场凝胶中分离出的DNA 片段进行扩增。加入的寡聚核苷酸的 性质对确定这些反应中的参数是关键的。

我们希望能设计出可从一个Alu重复子的两 个方向进行扩增的引物，从而使循环进行PCR前需酶切模板，并再连接环化)，避免要 求在相邻区域要有两个Alu重复子才能扩增的条件。

从克隆 的基因组DNA 进行AluPCR当与紧邻克隆 位点的载体序列末端引物结合起来时，AluPCR引物可直接克隆 DNA 中人 的插入序列。

这对于从YAC克隆 中分离插入片段特别有用，而别的方法则繁琐和费时 用这个方法，我们从约75%的含人插入片段的YAC克隆 中分离出片段，并用这些片段作 探针测定YAC插入片段在体细胞 杂合子图谱中的染色体定位。

这个方法用于Lambda噬 菌休载体中的克隆 时，可不需培养噬菌体来提取DNA 不能从插入片段得到探针，所有 的Lambda克隆 在这些反应中都已产生产物，所有的产物用染色体图谱定位探针时都得出预期结果。

这可为克隆 的DNA 定位节约大量时间。重要的是，与在体细胞 杂合子中 扩增相反，克已克隆 的人DNA 片段上进行扩增所用的引物不必是人特异的，大部分测 试Alu引物都产生产物。

AluPCR产物的带形对分析体细胞 杂合子和已克隆 的序列中人类DNA 区域也是有用的， AluPCR片段(APF)可?#147;指R怯形”法用来测定杂合子或克隆 间的重叠区域?舛圆舛哂 行》肿恿¤(1-10Mbp)人基因区的体细胞 杂合子人DNA 序列的性质和范围极为有用， 而用其他方法分析将十分困难。

APF也可作为另一种方法YAC载体中克隆 间的重叠区 域，用?#147;指克隆 ?#148;法则将十分困难。__AluPCR对分离和分析复杂背景中小区域的人 DNA 有极大的潜力，它也为从相似的复杂区域中寻找和分离重要序更提供了途径，并 且快不速、价廉、操作简单。

AluPCR应该成为减少基因组复杂性的重要方法。