PCR偶联连接酶链式反应在临床诊断及流行病调查中的应用

PCR偶联连接酶链式反应在临床诊断及流行病调查中的应用是利用一种测定DNA序列中单碱基突变的DNA扩增技术的一种PCR。即以序列互补方式杂交到一个靶分子的相邻寡核苷酸探针,可被热稳定DNA连接酶连接；若引物连接处有1个碱基不配对,则2条引物不能被连接,扩增反应不能进行。

PCR偶联连接酶链式反应在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是通过常规PCR扩增待检基因，用设计的简并引物与该基因进行复性，通过连接酶将匹配分子连接在一起的反应。

PCR偶联连接酶链式反应在临床诊断及流行病调查中的应用可用于病原体检测和遗传病检测。

材料：

①Taq酶；
②缓冲液；
③dNTP；
④引物；
⑤模板。

试剂：

①LCR缓冲液(20 mmol/L Tris- HCI pH7. 6，

10 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCI，

10 mmol/LDTT，1 mmol/L NAD+ )；
②T4 DNA连接酶。
引物标记试剂：
①T4多聚核苷酸激酶(10 U/μl) 及其缓冲液(0. 5 mol/L Tris HCI pH7. 6，100 mmol/LMgCl2，100 mmol/L 巯基乙醇)。
②[>-2P] ATP (6000 Ci/ mmol= 60 pmol ATP), ATP (20 mmol/L)，- 70 °C贮存。
③TE缓冲液(pH8.0)。
④末端脱氧核苷酸转移酶(17 U/μl)，

5X末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液

(500 mmol/L 二甲胂酸钠pH7. 2，1 mmol/L DTT，

10 mmol/L CoCl2)。
⑤地高辛-11-ddUTP溶液(1 mmol/L)。

检测同位素标记的LCR产物所用试剂：

①TBE缓冲液；
②聚丙烯酰胺凝胶；
③显影液；
④定影液。

检测非同位素标记的LCR产物所用试剂：

①亲和素；
②抗地高辛抗体Fab片段偶连碱性磷酸酶；
③T缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl pH7. 5,150 nmol/L NaCI),

磷酸盐缓冲液(pH9. 6)，结合缓冲液(1 mol/L NaCl, 0.75 mol/L NaOH)；
④干奶粉；
⑤鲑精DNA (10 mg/ ml)。
⑥CAMLIGHT (Camera Luminometer System)。

PCR偶联连接酶链式反应在临床诊断及流行病调查中的应用的基本过程可分为如下几步：

A. PCR克隆待检基因。

注意事项：利用常规PCR从待检测的多种样品中克隆待检测基因，纯化备用。

B. LCR引物的标记。

(1)LCR引物的同位素标记
①准备标记混合物: 15 pmol 引物，

2 μl 10×T4多核苷酸激酶缓冲液，

1. 5 μl T4多核苷酸激酶(10U/μl)，

4 μl [y-3P] ATP,加水至20 μl。
②37 °C，温育45 min。
③加人1 μl未标记的ATP, 37C温育2 min。
④加人0. 5 μl 0. 5 mol/L的EDTA以终止反应。
⑤65 °C保温10 min。
⑥NAP型柱纯化引物。

(2)LCR引物的非同位素标记
①5'端磷酸化反应300 pmol 引物，

3 μl 10×T4多核苷酸激酶缓冲液，

1 μl ATP, 6 UT4多核苷酸激酶，加水至30 μl。

37 °C 温育45 min，65 °C 保温10 min。
②3'端地高辛标记反应50pmol磷酸化引物，

8 μl 5×末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液，

2 μl地高辛-11-ddUTP，85 U末端脱氧核苷酸转移酶，

加水至40 pul。37 ℃温育45 min, 65 ℃ 保温10 min。

用水稀释至100 nmol/L。

C.标准LCR操作步骤。

（1）准备LCR反应缓冲液: 1 μl DNA样品，2.5 μl LCR缓冲液，

2 μl β烟酰胺腺苷二核苷酸(NAD+，12.5 mmol/L)，

1 μl 鲑精DNA (10 mg/ml)， 0.5 μl每种标记引物

(50 nmol/L， 终浓度1 nmol/L)，1.75 μl每种未标记引物(15 nmol/L， 终浓度为1 nmol/L)， 1 μl DNA连接酶(37.5 U/μl)。
（2）将反应管置于热循环仪上，94 °C 1 min, 65 °C 4 min,

进行10~30 次循环。同位素标记的LCR法可循环30次，非同位素标记法可循环10次。
（3）加20 μl终止液(用于放射性检测)终止反应，- 20 °C贮存。

D.分析LCR产物

(1)分析同位素标记的LCR产物

①制备16% 的聚丙烯酰胺凝胶，灌上TBE缓冲液。
②90 °C将产物加热5 min，170 V恒压电泳约1 h。
③将胶片置于胶上，- 20 °C感光12~24 h，冲洗、显影。

(2)分析非同位素标记的LCR产物

①在高结合性酶联多孔板上每孔加入60 μl亲和素，37 °C温育1 h。
②加入200 ul封闭液，室温封闭20 min。
③200 μl T缓冲液洗涤2次。
④以无吐温的T缓冲液40 μl稀释LCR混合物。加5μl至孔中并加入10 μl板结合液，室温温育30 min。
⑤T缓冲液洗涤2次。
⑥200 ul的0. 01 mol/L NaOH+0.05% 吐温洗涤2次。
⑦T缓冲液洗涤3次。
⑧加50 μl的抗地高辛配基抗体Fab片段-AP偶联物，室温温育30 min。
⑨T缓冲液洗涤6次。
⑩加入50 μl的Lumi- phos530, 37 °C温育30 min。
⑪用Polariod 612型胶卷曝光，时间1~5 min。多孔板荧光光度计可分析化学荧光强度。

1. LCR引物的设计。

下游引物的5'端加上两个或多个非互补性核苷酸尾巴有助于减少不依赖靶分子的假阳性连接。两条引物的Tm值应局限在-一个比较狭小的范围，一般在68~72C。两条引物之间不能配对，防止产生靶分子的非依赖性连接。引物的3'端碱基对的特性似乎会影响连接反应的效率。以GC方式杂交较以A-T方式杂交的引物产生更高的连接效率。

2.操作中的注意事项。

高浓度的引物可以增加产物的量，但同时增加非特异性连接的比例，引物的终浓度一般在0.5~5 nmol/L之间。最佳的同位索标记的引物浓度不一定适合非同位素法的LCR。

在LCR缓冲液中加人0.01% ~0.1% 的TritionX-100可提高连接效率，但同时也会增加非配对产物的量。因此，选择合适的浓度也很重要。循环条件: 94 °C变性15 s~1 min，其后是60~65 °C退火4~6 min。和PCR中的延伸过程不同，LCR在变性和复性之间不需要延伸，仅进行10~30个循环，具体循环数因不同方法而异。

3.检测结果中的注意事项。

在分析结果时，若无LCR产物，可能是引物的磷酸化水平较低，此时要注意精心制备ATP，并避免反复冻融。在微孔板检测系统中出现的问题十分复杂，因为不连接的引物不被显示，无法确定引物是否被生物素或地高辛配基正确标记。

能显示非同位素引物和LCR产物的方法是将它们在聚丙烯酰胺凝胶_上分离，电转移到另一块膜上，然后以抗地高辛抗体检测地高辛标记的引物，或用酶联亲和素检测生物素标记的引物。

微孔板封闭无效容易造成检测结果的假阳性。将鲑精DNA煮沸并在冰上冷却后制备成新鲜的封闭液可解决该问题。