PCR反应体系

1．缓冲液 标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl ， pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶 的活性中心，一般使用 Mg2+ ，有时使用 Mn2+ 。一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。

2．脱氧核苷三磷酸（dNTP） 脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度）。 dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。

3．引物 在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，即 1pmol/ml ， 在 100 μl 反应体系中相当于6x10 13 个分子。如果 5% 用于扩增 1kb 的 DNA 片段，可得到 3.3 μg 的产物，足以用于常规分析。

引物设计一般要考虑以下几个问题： ① 长度：至少 16bp ，通常为 18-30bp ，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。 ② 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5℃ 。对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。 对于 14-70 个核苷酸的引物可用以下公式计算。 Tm=81.5+16.6（1g[K+]）+0.41（G+C）%-（675/N） N 表示引物的核苷酸数目， [K+] 表示单价离子即钾离子的浓度。 ③ 避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基），从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。 ④ G+C 含量：尽量控制在 40% 至 60% 之间， 4 种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3" 末端的重复排列。 ⑤ 引物的 3" 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。 4．模板 模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR 扩增，10 4 至10 7 个模板分子可达到满意的效果。用人类或哺乳动物基因组 DNA 进行扩增时，一般使用 1μg DNA , 相当于单拷贝基因有 3×10 5 个拷贝。以酵母菌、细菌、质粒和 M13 噬菌体噬菌斑的 DNA 作模板时，要达到这么多拷贝数分别需要 10ng，1ng，1pg 和 1% 噬菌斑。