原位聚合酶链式反应（in situ PCR）和原位反转录

（一）、仪器设备    英国 Thermo Hybaid 原位 PCR 仪。    （二）、操作流程      1 、原位 PCR 步骤      1 ）预处理：      （ 1 ）切片常规脱蜡；      （ 2 ） 0.2mol/L HCl 处理 10min ；      （ 3 ） 5 μ g/ml 蛋白 酶 K 消化组织 37 ℃ 10min ；     （ 4 ） Nase 消化组织 37 ℃ 30min ；      （ 5 ）梯度酒精脱水，室温干燥。      2 ）原位扩增：      （ 1 ）切片滴加特异性序列引物 30 μ LPCR 扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；      （ 2 ） PCR 热循环： 94 ℃， 1min ； 55 ℃， 1min ； 72 ℃， 1.5min ，共 25 ～ 30 个循环， 72 ℃延伸 10min ；      （ 3 ）氯仿洗去盖玻片， 4 ％多聚甲醛后固定 10min ，梯度酒精脱水，干燥。      3) 原位杂交：      （ 1 ）加地高辛标记探针的杂交液， 98 ℃变性 10min ， -20 ℃退火 5min ， 42 ℃杂交过夜。      （ 2 ）杂交后用 2×SSC 洗涤 10min ， 3 次， 1×SSC 洗涤 10min ， 3 次；      （ 3 ）缓冲液洗涤 10min ， 3 次；      （ 4 ）加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物， 37 ℃， 2h ；      （ 5 ）缓冲液洗涤 5min ， 3 次；      （ 6 ） NBT 、 BCIP 暗处显色，镜下控制，终止显色。     （ 7 ）常规脱水：透明、封固。     2 、原位 RT-PCR 步骤    1 ）预处理：      （ 1 ）蛋白 酶 K(0.3mg/mL) 54 ℃消化 20min ，蒸馏水洗；      （ 2 ） 95 ℃加热 3min ，灭活残存的蛋白 酶。      2 ）原位扩增：      （ 1 ）在有 RNA 酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应；      （ 2 ）用热启动法进行 PCR 扩增。标本加热至 75 ℃时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至 95 ℃， 2min 。再将热循环仪设定为 95 ℃， 45s ， 55 ℃， 1min 和 75 ℃， 45s ，共 26 次循环；      （ 3 ）扩增结束后，在 80 ℃烤 15min ～ 30min 。      3 ）原位杂交：      （ 1 ）杂交前标本 95 ℃加热 3min ；      （ 2 ）加上杂交液，湿盒内 50 ℃过夜； 杂交液组成： 25 ％硫酸葡聚糖， 2×SSC ， 50 ％甲酰胺， 0.33mg/ml 变性的鲑鱼精子 DNA ， 每 0 ． 5mL 杂交液内含生物素标记探针 1ng 。      （ 3 ）扩增的β - 肌动蛋白 和 IL-6 用 DAKO 检测试剂盒 K600( 链霉卵白素，生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝 ) 检测。阳性反应呈紫色。    

上一篇：SMART技术   下一篇：免疫PCR(Immuno-PCR)概念和基础